点找对,单细胞数据挖掘仍然轻松上12+
作为一门重要且独立的自然学科,生物信息学在医学科研工作上的正确使用方式,应该是为研究者寻求无法通过经典生物学实验探索的研究方向,或者是将众多的候选分子进行初步筛选,国外很多学者就是这样使用了几十年,而生物信息学在国内的使用却逐渐变了味道。当然,小编不是说这样不好,任何现象的产生在特定时空下都是合理的。只是觉得做任何事情都不要太过,过犹不及。如果太多的以生信为主的文章发表,会很大的影响潜心做实验的学者的科研动力;同时,让很多圈外人对生信产生误解。
截止到目前,基于纯生信或者生信为主的行文思路已经被发表的差不多了,特别是近两年国内各大医院发表了很多以生信为主的SCI论文,使得国外的编辑都不胜其烦。事实上,这种错误的导向对生信这门学科的发展是十分不利的,因为目前的这种科研怪相使得很多科研学者对生信存在误解。即便如此,我们偶尔还是能看到一些出彩的生信数据挖掘文章,今天Immugent通过今年发表在Journal of Pineal Research(IF=12.08)杂志上的一篇文章,篇名为:Single-cell transcriptomic analysis reveals circadian rhythm disruption associated with poor prognosis and drug-resistance in lung adenocarcinoma,来讨论一下如何设计高分的数据挖掘行文思路。
图1:
这篇文章也是国人做的,它立意新奇、研究的角度新颖,并且使用多套数据进行扎实的论证。正所谓干湿结合才是王道,只有发挥两大科研手段的优势,才能做出真正意义上的好文章,这篇文章在最后还对筛选出的关键分子进行了实验验证。总的来说,作者立足于肺腺癌患者的恶性细胞的昼夜节律紊乱而开发了一种新的算法计算昼夜节律紊乱分数(CRDscore),并在肿瘤进展、治疗抵抗、代谢异质性、TME重塑等多个角度证明了CRDscore的价值,全文结构清晰,逻辑严密,因此非常值得我们学习。
1. 有关昼夜节律的那些事
考虑到很多人对昼夜节律的研究知之甚少,为方便大家理解,小编先通过两篇之前发表的研究对昼夜节律的基础知识进行科普。
众所周知,大多数人每天都会拿出至少四分之一的时间用来睡觉,而且很多人都会有夜里睡不好白天没精神的经历,由此可知昼夜节律对人体的影响是巨大的。并且2017年的诺贝尔生物医学奖(Nobel Prize in Physiology or Medicine)的获奖者,就是三位在昼夜节律研究方向上做出卓越贡献的科学家,他们分别是美国布兰迪大学的Jeffrey C. Hall, Michael Rosbash和美国洛克菲勒大学的Michael W. Young。
有关昼夜节律的研究方向有很多,而近些年才开始出现有关昼夜节律对肿瘤生长的研究。其中2020年发表在Science Advances 杂志上一篇题为 Circadian disruption promotes tumor-immune microenvironment remodeling favoring tumor cell proliferation的论文引起了肿瘤研究者的广泛关注。
图2:
研究人员想知道慢性时差如何影响癌细胞周围的微环境,并对两组注射了黑色素瘤细胞的老鼠进行了研究。第一组作为对照,暴露于正常的昼夜节律:12 小时的光照和 12 小时的黑暗。第二组模拟了慢性时差,明暗暴露每两天偏移六小时,效果相当于每周在 21 个时区漫游。一个月后,科学家观察到,慢性时差组小鼠的肿瘤大约是对照组的三倍。
图3:
他们还检测了肿瘤周围微环境,以及产生免疫细胞的脾脏和肝脏的样本。研究人员发现,两组小鼠免疫系统对肿瘤的反应方式截然不同。例如,在慢性时差组中,巨噬细胞等不同类型的免疫细胞水平出现反转,使其更倾向于促使肿瘤生长。同样,其他免疫细胞和分子(包括细胞因子)的节律也被破坏。即使肿瘤没有扩散到附近的器官,肝脏或脾脏中,科学家们也观察到这两个器官的免疫系统昼夜节律变化都受到了抑制。
2. Nature重磅研究揭示乳腺癌细胞夜间加速转移
有关昼夜节律对肿瘤生长影响的另一项重磅研究,就是最近发表在Nature杂志上的一篇题为:The metastatic spread of breast cancer accelerates during sleep的研究。研究在乳腺癌患者和小鼠模型中都检测到了意想不到的循环肿瘤细胞(CTC)动态生成模式,发现癌细胞的转移与作息、特定激素水平密切相关,大多数自发的CTC血管内渗事件发生在患者的睡眠期间。
图4:
首先,研究人员共入组30名乳腺癌患者,包括21例早期乳腺癌和9例晚期乳腺癌患者。随后,分别在上午10点(清醒)以及凌晨4点(熟睡)两个阶段收集其血液样本。这些患者都处于未接受治疗或暂时停止治疗的状态,且部分患者为早期未转移阶段,部分患者已经发生转移。检测结果显示,大部分CTC都来自于夜间获取的血液样本。
此外,研究团队证明了睡眠期的CTC很容易转移,活跃期产生的 CTC缺乏转移能力。CTC的单细胞RNA测序分析显示,在睡眠期和活动期的乳腺癌患者和小鼠模型中,CTC的分子基因表达模式不同。其中,睡眠期间的基因表达由有丝分裂和细胞分裂基因主导,有丝分裂基因均在睡眠期显著上调,从而提高了CTC的转移能力。在活动期,患者和小鼠模型的CTC核糖体生物发生和基因翻译通路的活性增强。此外,这种基因表达变化在原发肿瘤中也观察到,表明这是乳腺癌细胞在疾病进展过程中发生的一种普遍现象。
图5:
基于以上发现,研究人员认为具有高转移倾向的CTC的自发产生并不是持续发生的,而是集中在患者的睡眠期,这一发现为针对癌症转移分析和治疗提供了新的理论基础。肿瘤的转移扩散是通过CTC的血液播散实现的。但决定具有转移能力的CTC产生的时间动态在很大程度上是不明确的,通常认为CTC是从不断生长的肿瘤中脱落或由于机械损伤而脱落的。该研究发现,与活动期产生的CTC相比,睡眠期产生的CTC分裂更快,因此更可能形成肿瘤转移。
文章读到这,可能很多能看懂这项研究的肿瘤患者都睡不着觉了。但是这项研究的作者Qing-Jun Meng告诫人们,不要将睡眠视为癌症患者的敌人。大家更需要注意的是相对于拥有正常睡眠的肿瘤患者,每晚睡眠时间通常少于7小时的人死亡风险更高,且科学家已经证实昼夜节律扰乱的老鼠,其癌症转移得更快。老祖宗的话永远都是对的,吃得好睡得好身体才倍棒。因此,好的身体才有较强的免疫功能,才能更好的控制肿瘤。
3. 昼夜节律紊乱与肺腺癌的不良预后和耐药性有关
在了解有关昼夜节律基础知识后,小编开始介绍今天这篇文章的主要内容。
这项研究的作者首先整合了来自 GSE131907和 GSE123904的 30 名 LUAD 患者的原发(n = 17) 、远处转移(n = 10) 和化疗期间(n = 3))肿瘤组织的单细胞数据。随后,按照上皮评分鉴定出恶性细胞,发现恶性细胞的数量随着癌症阶段的进展而增加。紧接着,作者又发现恶性细胞来自相应cluster在不同样本的相对比例明显不同,这说明了恶性细胞的异质性。随后对恶性细胞的2091个昼夜节律相关基因的矩阵进行WGCNA分析,对相关的358的基因的网络进行了可视化。最后,作者基于358个基因开发了算法量化恶性细胞的CRD,随后对单细胞数据按照CRDscore着色。通过对CRDhigh和CRDlow组进行了富集分析,CRDhigh组显示糖酵解、G2M检查点、MYC靶通路等影响肿瘤生长的相关通路。对不同样本来源的恶性细胞进行GSVA分析发现远处转移患者的恶性细胞CRD、EMT和血管生成评分更高而化疗后患者的DNA修复、p53相关的凋亡通路更为活跃。
图6:
随后,作者在另一个独立的接受了TKI治疗的22名肺癌患者的单细胞队列中研究了CRDscore与肿瘤耐药之间的关系。研究结果发现恶性细胞在PD(progressive disease)组患者中比例更高且具有更高的CRDscore恶性细胞有较高的TKI组特异性。通过按照TKI打分和CRDscore打分进行分组后,作者发现CRDhigh的细胞大多都在PD组。按照不同分组比较,PD组、转移组和晚期组的CRDscore较高。最后,作者将患者按照CRDscore分为了两组,结果发现CRDhigh组的患者TKI反应率显著低于CRDlow组。
图7:
紧接着,作者将两组病人的表达数据差异分析然后富集分析发现糖酵解、氧化磷酸化和自噬途径在CRDhigh的PD和TN(before initiating targeted therapy)患者中同时富集,以上结果表明CRDscore高可能与TKI耐药有关。此外,细胞因子通路在CRDhigh组被激活而与TKI结果无关,在PD和RD(complete or partial response state)之间糖酵解和细胞衰老信号的激活存在显著差异。糖脂代谢相关基因如GPI、IDH1和DLD在CRDhigh患者的恶性细胞中高表达,G6PD、HK2、ALOX5和DGKA的表达水平与CRDScore呈正相关。表明能量代谢与CRD之间的联系可以解释恶性细胞的耐药状态。
4.肺腺癌细胞昼夜节律基因的相互作用和功能验证
利用单细胞数据进行细胞通讯分析可以在单个细胞水平揭示各种细胞之间的相互调节作用,作者通过细胞通讯展示CRD高低组恶性细胞、巨噬细胞与T细胞亚群的配受体相互作用,结果显示CRD改变了恶性细胞的趋化因子总体表达水平,CRDhigh抑制了恶性细胞产生的共刺激信号而共抑制细胞因子显著升高这可能是T细胞减少和耗竭的原因。CRD下的M1和M2巨噬细胞对T细胞表现出不同的共抑制和共刺激信号效应。恶性细胞和巨噬细胞协同作用激活了CRDhigh组的Th2和Treg,诱导一组协同调节的LRS则增强了CD8+T细胞与CRDLOW的积累。研究CRDhigh中被激活的细胞因子通路发现这些通路的活性水平与源自T/巨噬细胞的细胞因子信号正相关,这说明了CRD不同对TME组成的影响,CRD可能是LUAD中T细胞积累的主要调节因子。
图8:
最后,作者用体外细胞功能实验验证了自己的发现,即在支气管上皮细胞系 BEAS-2B 中检测到核心昼夜节律基因表达的变化,但在 NSCLC(A549 和 H1299)细胞中表现出不同的特征,与对照细胞相比,H1299 细胞中 CLOCK 的表达显著增加。在使用 siRNA (siCLOCK) 或褪黑激素预处理敲低 CLOCK 后,细胞显示出侵袭性受损。
随后,作者通过RNA测序评估了基因表达模式,总鉴定基因的PCA显示治疗组明显聚集,褪黑素处理组与对照组差异大于siCLOCK组与对照组之间的差异,对照组的内部变异小于在治疗组中。对组间的差异表达基因进行GO分析,揭示了接受抗 CRD 治疗的细胞的独特特征。褪黑激素处理细胞特有的GO术语与昼夜节律、能量稳态和对氧化应激的反应等有关,且CRDscore与EMT的标志物之一SNAIL的转录水平呈正相关,褪黑激素孵育可以显着抑制 CRDscore 和 SNAIL 的蛋白质水平。证明了抗CRD治疗可以减弱CRD状态以及癌细胞的侵袭能力。此外,根据DEGs的GSEA,发现褪黑素显著逆转缺氧和衰老信号,这可能提示了新的方向。
图9:
由于文章内容较多,Immugent只挑出几幅主图进行讲解,想系统学习这篇文章的小伙伴可以去认真研读一下原文。总的来说就是作者立足于肺腺癌患者的恶性细胞的昼夜节律紊乱而开发了一种新的算法计算昼夜节律紊乱分数(CRDscore),并在肿瘤进展、治疗抵抗、代谢异质性、TME重塑等多个角度证明了CRDscore的价值,在单细胞和bulk水平验证了结论并在体外功能实验验证了抗CRD治疗可以减弱 CRD 和癌细胞的侵袭性。为 CRD 在癌症进展和治疗抵抗中的作用提供了新的见解。研究结果加深了对由 CRD 引起的代谢异质性和 TME 重塑的理解。
5.展望
到目前这个行情,想依靠纯生信发高分文章就必须有新颖且高端的科学问题,今天分享的这篇文章就是着手于昼夜节律这个科研热点,但它又不是生硬的蹭科研热点。从这篇文章发表的时间看(4月份),是早于今年的那篇Nature的(7月份),因此小编相信这个文章的立意肯定是作者在平时对相关领域的领悟而发现的。
此外,这篇文章的作者将要说的故事逻辑一步步展开,逐渐深入,而且每一步都有坚实的数据分析做支撑。虽然最后有实验验证,但都是一些最基本的细胞实验,这肯定不是这篇文章能发表在12+的主要原因。因此,这篇文章之所以能被编辑喜爱,肯定是因为其基于多套数据,包括单细胞数据和bulk数据的互相验证,这些都值得我们学习。
昼夜节律对机体的影响是一个非常重要的科学问题,而且这可以做一系列的研究。特别是在如今的社会,很多年轻人普遍昼夜颠倒,这会不会和肿瘤发病率升高有关?其次,除了肿瘤,其它疾病,如自身免疫病,免疫缺陷病是否也和昼夜节律相关?这些都还是未知。这篇文章只是对昼夜节律对肺癌的影响进行研究,那对其他肿瘤的影响呢?特别是一些内分泌型肿瘤,小编相信也可能会有潜在的重要发现。但是,归根结底,无论从哪个角度出发,都要联系实际的临床意义;而且如果先从数据挖掘着手,必须保证有庞大的公共数据做支撑;最后,如果能设计一些简单的实验进行后续验证,即使不能作为文章的主要亮点,但仍会使编辑更加青睐于你的研究结果。
[参考文献]
[1] Aiello I, Fedele MLM, Román F, Marpegan L, Caldart C, Chiesa JJ, Golombek DA, Finkielstein CV, Paladino N. Circadian disruption promotes tumor-immune microenvironment remodeling favoring tumor cell proliferation. Sci Adv. 2020 Oct 14;6(42):eaaz4530. doi: 10.1126/sciadv.aaz4530. PMID: 33055171; PMCID: PMC7556830.
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