SXR202305014C+遗传免疫逃逸研究，看完这篇搞定~

免疫逃逸机制导致肿瘤细胞不被杀死，大大降低免疫治疗疗效。全面了解免疫逃逸分子机制有助于筛选可获益患者，制定针对特定逃逸方式的靶向治疗。今天给大家分享一篇发表在Nature Genetics（IF：38.585）杂志上的文章，主要研究遗传免疫逃逸相关6条重要通路上的基因在癌症转移前后的改变状态对比，全面深入阐述泛癌种的遗传免疫逃逸景观和分子机制，让我们正式开始吧~

研究背景

癌症免疫逃逸使得肿瘤细胞逃脱免疫系统杀伤作用，是肿瘤特异性突变的累积效应，通过免疫逃逸相关肿瘤特异性基因组改变（GIE）被MHC-I呈递到细胞表面的新抗原表位体现。多种生物机制导致免疫逃逸，包括新抗原表位呈递减少或完全缺失，抑制来自周围免疫细胞的促凋亡信号。抗原呈递一般重点关注HLA-I基因，由于其在人群中的巨大多态性（>15,000种），以及肿瘤中也会检出HLA-I 基因突变，极大增加HLA status检测难度。HLALOH、B2M突变、HLA唯一性位点数量减少等都是已知的GIE事件，在原发肿瘤中被广泛研究，而晚期转移性肿瘤中GIE相比原发肿瘤发生率的一致性或动态改变，由于缺乏广泛研究，两者的差异尚不清楚。

研究结论

来自荷兰乌得勒支大学医学中心的研究人员，对收集自Hartwig（n=4,439）和PCAWG（n=1,839）的6319例泛癌肿瘤样本进行6条免疫逃逸途径中GIE发生率的泛癌表征。6条途径指的是HLA-I基因座、抗原呈递机制、干扰素IFN-γ信号通路、PD-L1免疫检查点、CD58受体的共刺激信号和SETDB1驱动的表观遗传免疫逃逸（图1a）。研究发现，1/4的患者中出现GIE事件，不同癌症类型中GIE相关生物机制和频率具有很大差异。原发性和转移性肿瘤的GIE发生率一般是一致的，说明GIE是肿瘤早期事件。肿瘤进化过程中GIE改变被选择，其中HLA-I focal LOH代表最大的新抗原表位库。在高TMB肿瘤中，HLA-I focal LOH代表免疫逃避机制趋势，而在超突变肿瘤中，其他免疫逃避机制占主导地位。同时本文研究人员开发了LILAC，一个综合检测HLA status的开源集成框架，实现HLA分型的同时可以检测HLA-I基因非同义突变、纯合缺失变异、LOH等。

研究成果

LILAC推测肿瘤中HLA-I状态

肿瘤样本HLA-I status推断是识别GIE改变的基础，利用LILAC工具对6279名患者的正常和肿瘤样本分别进行HLA-I基因分型（图1b），相比Polysolver和xHLA，LILAC具有最高的一致性（图1f）。所有分型工具在Hartwig数据集上都具有较高的一致性（图1c），可能是由于该数据集较高的测序深度和数据质量。基于三人组家系的HLA-I分型结果显示，LILAC与先前报道的分型结果完全一致（图1d）。LILAC对TRACERx100肺癌队列WES数据HLA-I分型结果具有98.16%的一致性。对95个之前有研究表明较难准确分型的样本，LILAC分型结果显示出100%的一致性，高于Polysolver（93.09%），xHLA（98.94%）。LILAC在7个肿瘤活检样本中检出9个HLA-I体细胞突变。

LILAC根据比对到每个allele的片段数和基于纯度矫正计算拷贝数方法，得到minor或major等位基因特异性倍性水平，以此来检测HLA-I LOH。对TRACERx100肺癌队列WES数据分析结果显示，LOHHLA和LILAC具有90%的一致性，其中高肿瘤纯度样本（>=0.3，96.08%）相比低肿瘤纯度样本（<0.3，75.51%）具有更好的一致性（图1g）。LILAC检出HLA-I LOH的3个肿瘤样本，采用正交实验方法验证后显示强烈的等位基因不平衡性。

图1.基于LIAC推断肿瘤中HLA-I状态

不同癌种中GIE发生率和 途径对比

研究队列中包括1880例PCAWG原发患者和4,439例Hartwig转移患者（图2a），这些患者总共分为58种癌症类型，其中包括转移队列中具有足够高代表性(患者数量≥15)的30种肿瘤类型（图2b），原发队列中27种高代表性癌类型，原发和转移队列中都具有高表达性的20种肿瘤类型。分析结果显示，四分之一的患者(26%的转移性患者和24%的原发性患者)在六种研究途径中出现了GIE改变（图2c-d）。转移性队列中，每种癌症类型中存在GIE改变的患者比例中位数为0.27，原发肿瘤中为0.20，两者均显示出高度分散的分布（±0.15 sd和±0.19 sd）。在某些癌症类型中，如胰腺神经内分泌(PANET，转移性)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(DLBCL，转移性)和肾嗜色癌(KICH，原发性)，>50%的患者样本中存在GIE(分别为65%、55%和74%)，而在其他癌症类型中，如肺神经内分泌(LUNET，转移性)，GIE是极其罕见的事件(图2e-f)。

图2.不同癌症类型中GIE概览

最常见的GIE改变是HLA-I LOH(包括HLA-I基因杂合性缺失和纯合缺失)，在783例(18%)的转移性癌症患者和319例(17%)的原发性癌症患者中检出，其次是IFN-γ失活(4%的转移性癌症患者和3%的原发性癌症患者)和抗原呈递途径的改变(4%的转移性癌症和3%的原发性癌症)。CD58失活是最不常见的免疫逃逸事件，仅在16例转移性患者和8例原发患者中出现。KICH和PANET肿瘤高GIE发生率完全是由于HLA-I LOH，而其他类型的癌症表现出更广泛的GIE机制。本研究中没有观察到在具有多种GIE机制的癌症类型中，HLA-I LOH和其他GIE事件之间存在显著的互斥性，表明某些肿瘤可能需要互补的GIE改变，例如破坏HLA-I介导的新表位呈递和CD58丢失的同时改变，以有效地逃避免疫监视。

原发和转移肿瘤样本中GIE发生率对比

在原发和转移队列中具有充分代表性的20种癌症类型数据GIE结果比对显示，两者之间存在广泛的一致性（图3a）。其中9种肿瘤有一定程度的转移肿瘤样本GIE富集(log2(OR) > 0.5)，但只有前列腺癌(PRAD)和甲状腺癌(THCA)的差异具有显著性（图3b），可能与癌症转移过程中大量的基因组转化有关，THCA转移富集是HLA-I LOH发生率增加的结果，而PRAD的差异是多种免疫逃逸途径广泛富集的结果。

图3.原发和转移肿瘤样本的GIE发生情况

HLA-I基因突变的正向选择

对泛癌队列数据进行HLA-I（HLA-A、HLA-B、HLA-C）基因变异检测，其中无义突变、可变剪切变异、截断变异的dN:dS>1，说明这些变异在肿瘤发生发展过程中被正向选择，导致突变率高于背景突变率(图4a)。对泛癌数据特定HLA-I基因进行变异检测发现，只有HLA-A和HLA-B的dN:dS>1，且变异集中在截断变异而不是错义突变(图4b-c)。对特定癌症特定HLA-I基因突变分析发现，HLA-A和HLA-B被认为是几种癌症的驱动因素，包括转移性结直肠癌、NSCLC、DLBCL等(图4e)。

HLA-I基因小片段体细胞变异（InDel）沿其序列均匀分布，除了移码变异HLA-A Lys210（chr6:29911899）在6个 dMMR转移癌症中被检出(图4f)。这种均匀分布与先前的观察结果一致，也符合以失活变异为主的抑癌基因的预期分布。

在HLA-I基因杂合子个体中，如果发生HLA LOH，会影响新抗原表位的呈递。本文对全基因组LOH事件按分辨率进行划分，nonfocal LOH：LOH影响染色体长度>染色体臂长度的75%；focal LOH：<75%；highly focal LOH：<3Mb，以以上分辨率对应LOH发生率为背景突变率，找出HLA-I LOH发生率显著高于背景突变率的癌症类型(图4g)。尽管与背景全基因组LOH率存在整体相关性，但在几种转移和原发癌症数据集中，HLA-I LOH发生率高于预期(G-检验，拟合优度Q值<0.1)。其中Panet和KICH富集nonfocal HLA-I LOH，转移性宫颈癌、转移性结直肠癌或原发DLBCL，富集focal HLA-I LOH或highly focal HLA-I LOH（图4h-i）。另外在33例发生HLA-I基因非同义突变患者（占159例HLA-I基因突变患者总数的20%)）中，同时发生LOH丢失可选的等位基因，可能导致整个HLA-I基因失活。

分析结果中没有发现任何双等位基因缺失变异，HLA-I基因纯合子缺失变异可能受到纯化选择的限制，表达最少量的HLA-I分子以逃避免疫系统报警。

图4.HLA-I的阳性选择

focal 与nonfocal HLA-I LOH发生的特定区域

在特定类型癌症中，HLA-I LOH被正向选择，计算其单个位点两个等位基因型预测新抗原表位数量之比发现(图5a)，等位基因新表位比率和具有最多新表位位点发生LOH频率在转移和原发肿瘤中呈正相关（图5b-c）。局限在HLA-I focal LOH事件时，新表位比率和丢失频率之间的关联变得更强(图5d-e)，但HLA-I nonfocal LOH不选择具有最高新表位库的等位基因（图5f-g），它在几种癌症类型中的高复发率可能与6号染色体上的其他选择力量有关。

图5.HLA-I LOH和新抗原表位负荷

大多数HLA-I LOH的拷贝数是中性的(转移性肿瘤和原发性肿瘤分别为81%和70%)，比nonfocal HLA-I LOH(转移性肿瘤和原发性肿瘤分别为65%和35%)要高得多，说明HLA-I LOH主要驱动力是丢失等位基因而不是基因剂量减少。

GIE突变（除了HLA-I）的正向选择

对除了HLA-I基因座以外的涉及5条免疫逃逸途径上的18个基因进行变异检测，除了两个基因的驱动机制是拷贝数增加，16个基因的无义突变、可变剪切变异和截断变异对应的dN:dS>1(图6a)，说明在肿瘤发生过程中被正向选择。对特定基因和癌症类型的细化分析表明，来自抗原呈递途径的两个基因(B2M和CALR)在几种肿瘤类型以及泛癌队列中显示出失活突变和局部双等位基因缺失的反复模式（图6b-d）。此外，包括JAK1、JAK2和IRF2在内的IFN-γ途径基因的局部双等位基因缺失频率也高于预期。CD58在DLBCL和泛癌原发队列中的非同义突变和纯合缺失的数量也高于预期。染色质修饰物SETDB1在多种癌症类型中反复局部扩增，包括转移性非小细胞肺癌和原发乳腺癌（图6e）。

图6.除了HLA-I以外的GIE事件阳性选择

其它与免疫逃逸相关的基因组特征

对38种癌症类型中99个肿瘤基因组特征和366个驱动基因进行了癌症类型特异性单变量Logistic回归，研究其他癌症基因组和环境特征，如免疫浸润特征、突变生物学过程特征、新抗原负荷、突变负荷等与GIE事件发生（排除nonfocal HLA-I LOH）的相关性(图7a)。为了控制可能继发于突变和CNV背景率增加导致的关联，过滤掉在GIE模拟中发现的重要关联。结果发现，35个基因组特征和5个驱动基因在至少一种癌症类型中显示出与GIE的统计学显著关联(图7a)。

即使在控制背景突变率后，TMB和新抗原表位负荷与DLBCL、胰腺癌和皮肤黑色素瘤的GIE事件密切相关。主克隆TMB和新抗原表位负荷显示出与GIE强烈的正相关，而亚克隆TMB和新抗原表位负荷显示出适度的相关性。在DLBCL和NSCLC中，融合衍生的新表位与GIE显著相关(图7b)。

暴露于某些内源性和外源性突变过程与免疫原性增强和对ICIs的反应相关，其中MMRd突变过程与GIE发生率增加广泛相关。暴露于胞苷脱氨酶APOBEC家族与多种癌症类型（包括乳腺癌）GIE密切相关（图7d）。与几种外源性突变过程相关的突变负荷，如皮肤黑色素瘤中的紫外线和NSCLC中的铂类化疗，也与这些癌症类型中GIE事件发生率的增加显著相关(图7e)。

一些肿瘤基因组特征也发现跟GIE发生率增加有关，在结直肠癌(也包括一些肛门癌患者)中，HPV DNA整合与GIE发生率呈正相关，在特定癌种类型中，通过RNAseq反卷积得到的高免疫浸润特征与较高的GIE发生率显著相关(图7f-g)。

图7.GIE相关癌症基因组特征

除了本研究中考虑的GIE途径之外，某些驱动因素的改变也显示出与GIE事件的强烈关联。在结直肠癌患者中，CASP8、KMT2D、RPL22和TGFBR2的改变往往与GIE同时发生。之前有文献报道，CASP8和TGFBR2的改变与免疫监视逃逸有关。

其它一些特征，如HLA-I超型、HLA-I种系分化、患者实际年龄或接受过包括免疫治疗在内的以前的治疗，都没有达到与GIE显著的关联。

TMB与免疫逃逸机制

突变负荷的增加导致新表位的产生易被适应性免疫系统识别为新抗原，在20个均匀分布的TMB区段中分析GIE改变频率(不包括HLA-I nonfocal LOH)与TMB之间的关系。研究发现，随着TMB的增加，GIE发生率稳定增加，观测到的GIE频率偏离了GIE模拟给出的预期频率，这在超突变的肿瘤中尤其明显，其GIE发生率比模拟高2-3倍（图8a）。考虑癌症类型和突变克隆性后，这一趋势仍然是一致的。基于HLA分型预测的新抗原表位负荷与GIE发生率一致均匀增加。

TMB：10-13，ICI反应预测阈值下限，平均GIE发生率为0.3±0.03 s.d；TMB：26-36，对应高突变肿瘤类型，平均GIE发生率为0.42±0.06s.d.； TMB：~95，超高突变肿瘤类型，GIE发生率>70%（图8a）。

进一步研究TMB跟6条免疫逃逸途径上的GIE事件相关性，HLA-I基因座相关变异发生率随着TMB增加而增加(图8c)。HLA-I nonfocal LOH主要存在于低TMB肿瘤中，HLA-I focal LOH在中高TMB肿瘤中明显富集，峰值约为每Mb ~ 10-20个突变(平均频率为0.22±0.04 s.d)，呈倒U型分布。HLA-I基因突变在高突变肿瘤中更为频繁(即从每Mb约26个突变到每Mb 36个突变)（图8d）。抗原呈递机制和IFN-γ通路的改变主要见于高突变肿瘤。其余的通路没有显示出任何明确的TMB偏好，可能是由于这些改变在本文研究数据集中的患病率较低。

图8.TMB和免疫逃逸机制

总结

本文描述了来自58种癌症类型的数千例统一处理的原发性和转移性肿瘤中涉及6个主要途径的GIE改变的患病率和影响。研究结果显示，平均而言，四分之一的患者发生GIE事件，主要是由于HLA-I LOH。GIE的发生率和靶向途径在不同的癌症类型中表现出高度的多样性。没有观察到针对不同途径的GIE改变之间的相互排他性，这表明多种GIE改变可能同时发生，有效地避免了免疫监视。在大多数癌症类型中，转移性患者的GIE改变发生率与原发性患者相当，表明GIE是肿瘤进化过程中的早期事件。在肿瘤进化过程中，免疫逃逸改变往往是被正向选择的。在多种癌症类型中，HLA-I LOH发生率高于预期。值得一提的是，随着TMB的增加，GIE发生率也稳定增加，这并不完全归因于背景突变率的潜在增加，这表明对免疫治疗反应最好的肿瘤也有最强的免疫逃逸能力。