大家好呀,今天分享的文章题为HPV+扁桃体癌中髓系细胞的单细胞分析,文章思路清晰,于今年一月发表在《Frontiers in Immunology》(IF = 8.786)上,让我们来一起学习一下吧!
Single-cell analysis of myeloid cells in HPV+ tonsillar cancer
一、背景
扁桃体鳞状细胞癌,简称短扁桃体癌(short tonsillar cancer,TC),是一种由扁桃体黏膜上皮细胞异常生长引起的头颈部癌(head and neck cancer,HNC)。人类乳头瘤病毒阳性(HPV+)扁桃体癌的发病率在过去几十年里急剧上升。而髓系细胞是一个适当的治疗靶点,因为它们靠近病毒感染的肿瘤细胞,并且能够在扁桃体内协调抗原特异性免疫。然而,稳态和炎症性髓系细胞亚群之间的相互关系及其对患者生存的影响尚未被探索。本文使用单细胞测序来绘制HPV+扁桃体癌的髓系腔室。
二、结果
1、HPV+ TC中髓系腔室扩张(包括树突状细胞亚群、单核细胞、巨噬细胞和少量HLA-DR+粒细胞)
使用流式细胞术表征和量化CD45+ CD13+ HLA-DR+髓系细胞群,TC组CD13+HLA-DR+细胞频率(n=8)较对侧HT组(n=5)明显增加,表明TC组髓腔扩大。为探究初始治疗的TC患者髓系细胞的多样性,从5个HPV+ TC活检和1个配对的对侧健康扁桃体(HT)中分选D45+ CD13+ HLA-DR+细胞进行分类,然后进行单细胞测序(图1A)。经过质控和聚类,得到9502个细胞并划分成12个细胞簇(图1B)。其特征是MHC II类编码转录本(如HLA-DRA、HLA-DRB1)和CD14(图1C)的异质表达在TC和HT中分布不同(图1D)。对12个细胞簇进行差异表达的分析,并进行细胞亚群的注释以及计算特征基因打分,发现cDC 1(簇3)在血液cDC1基因集得分较高;相反,cDC 2样细胞(簇0和簇6)在血液中的cDC2基因集得分较高。而祖细胞DC簇表现出与细胞周期和祖细胞相关的标记物,S和G2/M细胞周期阶段评分较高。(图1E,F)
2、DC谱系特异性亚群和细胞特性动态分析
作者又将DC重新划分成七个细胞簇, cDC2样的3个细胞簇特征为CLEC10A、CD1C和FCER1A的表达、血液和组织cDC2基因集的高评分以及其在TC和HT中的异质分布(图2A-C)。作者使用SCIENIC来评估细胞调控网络(图2D),发现cDC1祖DC和actDC在DC室中具有最明显的调控作用,而cDC2样细胞和DC5部分共享它们的调控网络。actDCs的特征在于RELB、HIVEP1和IRF1/2调控因子的高活性。基于簇之间的欧式距离进行分层聚类以评估它们的转录组相似性(图2E)。发现actDCs是最不同的组,结果与基因调控网络分析结果一致。接下来,作者利用RNA速率来分析细胞分化状态(图2F-H),发现CDC1和CDC2样细胞分支的RNA速度都指向actDC。CLEC9A和CLEC10A的连续缺失分别证实了cDC1s和CDC2样成熟为actDCs。RNA速度分析显示了一个连续的状态沿着祖细胞进入完全分化的cDC1簇,并发展到actDCs(图2E)。cDC1成熟为actDCs,最初CD40表达上调,随后CCR7、PRDM1、NFKB1、LAMP3、IDO1和MIR155HG表达上调。同样分析了cDC2样细胞,检测到RUNX3 cDC2和MAFB+ LC到RUNX3+ cDC2的强方向性,这些cDC2随后发展为actDC(图2H)。最后, 作者使用RNA速度分析评估cDC1和cDC2样细胞成熟为表达LAMP3的actDC的频率(图2I)。发现DC2样细胞比cDC1成熟得更频繁。在同一TC样本中,cDC1和DC2样成熟彼此之间并不相关,这表明这两个过程是独立的。
3、Mono-Mac子集显示肿瘤阶段的特定模式
作者又将Mono-Macs划分成6类细胞,它们在TC患者的TNM分期上具有不同的分布(图3A-C)。六簇细胞高表达不同的基因,值得注意的是,M1和M2相关基因并没有区分Mono-Macs簇,表明M1/M2的基因不能区分这两者之间的差异。无论肿瘤分期如何,除CXCL-Macro外,所有的Mono-Macs集群都在HT和TC中被发现。而CXCL-Macro仅在晚期原发肿瘤中检测到(图3B)。作者评估了Mono-Macs集群中的基因调控网络活性和转录因子的表达(图3D),Mono-Macs谱系共同表达FOS和FOSB,其中单核细胞具有更高的调控活性,基于簇之间的欧式距离层次聚类比较了Mono-Macs的转录组相似性(图3E),单核细胞和ISG(干扰素刺激基因)单核细胞,NLRP3和C1Q-Mac,以及CXCL和act-Mac分别配对一起。RNA速率分析发现单核细胞和ISG单核细胞分化为NLRP3和C1Q-Mac,然后分别极化为CXCL和act-Mac。接下来,作者通过分析高可变基因来评估Mono-Macs发育轨迹中的转录组变化(图3F),发现单核细胞、ISG单核细胞、NLRP3和C1Q-Mac上调IL1B和OLR1的表达,而这些基因在CXCL和act-Macro激活时表达显著下调。单核细胞和NLRP3-Mac具有NLRP3、S100A9、AQP9和FCN1的活跃转录特征。在进入CXCL-Mac时,这些基因上调MMP10和CXCL5。相反,ISG 单核细胞的ISG20和IDO1转录活跃,并在分化为C1Q和acts时分别上调HLA-DPB1、IL4I1和IRF4。这些结果共同表明,在Mono-Macs谱系轨迹的不同阶段存在一个核心转录程序。为了深入了解两个平行的Mono-Mac分化过程,我们在act-Mac和CXCL-Macros簇之间进行成对DGEA(differential gene expression analysis),然后进行GSEA(图3G)。act-Mac的特点是抗原呈递相关转录本的高表达和相应途径的富集。反过来,CXCL-Macros的特征是与粒细胞和中性粒细胞趋化相关的趋化基因、血管生成和与基质重塑途径相关的基因的高表达。
4、TC和配对HT中髓系异质性的验证
作者通过免疫荧光验证scRNA-seq在蛋白水平上检测到的髓系。对髓系细胞簇进行DGEA分析来选择蛋白靶点,使用scRNA-seq分析中鉴定的基因编码的蛋白质(XCR 1、CD1c、CD 14、CD 5、CCR 7、CD 1A、CD 207、SDC 2、HLA-DRA、CD 300 E、FCGR 3A和TNFSF 10)的抗体组评估了TC和HT衍生的单细胞悬液(图4A),鉴定了基因的表达并且加入了免疫检查点PD-L1、PD-L2、LAG3和BTLA以及共刺激蛋白CD40的抗体和B细胞抗体(图4B)。通过流式细胞术分析了10个低温保存的单细胞悬液,分别对应于7个TC和3对HT的活检。经过单线态过滤后,将活的CD45+ HLADR+ CD19- CD20-细胞连接起来,并在tSNE空间内可视化。观察到除CD16、LAG3、Ttrail、BTLA、CD34和CD300E外,所有标记物都有清晰的信号(图4C)。作者又建立了一种门控策略来定义人类TC和HT中的几种髓系群体,并比较了它们的PD-L1、PD-L2、HLA-DR、CCR7和CD40的水平(图4D-F),并发现每个亚群特异表达的基因和区分亚型的基因。为了评估TME诱导的转录组变化,用 scRNA-seq数据集中对TC和HT髓系群体进行了DGEA比较。TC中的祖DC表达了更高水平的cDC1典型基因和细胞周期基因,分别通过血液cDC1和细胞周期评分的富集来说明。相比之下,HT中的祖DC具有较高水平的典型cDC2基因和血液cDC2基因集评分。通过比较TC和HT之间的DEG,观察到所有DC簇中IFN反应相关基因的共同增加。相反,TC中所有髓系群体均显示出炎症小体调控基因MTRNR2L12、DNASE1L3和LGALS2以及MHC-II编码基因的下调。
5、在头颈部癌(HNC)患者中,cDC1s、活化的树突状细胞和巨噬细胞与HNC患者的生存期延长相关
作者试图评估TC和HT以及其它HNC中髓系群体的存在,访问了公开数据库的单细胞数据,内部的TC数据集中鉴定出的所有聚类簇也存在于HNC的其他亚型中。RUNX3-cDC2仅在头颈部癌(HNC)中轻微存在,表明这种细胞状态是针对上述健康组织的,并且发现HPV+和HPV-肿瘤之间的肿瘤浸润髓系细胞的多样性是相似的。为了研究HNC中髓系群体对预后的影响,从TC中分离出来的所有髓系簇进行了DGEA检测,总共获得了998个DEG。然后选择公开的HNC单细胞数据筛选差异基因,获得只在髓系中特异表达的3个DEG(图5A-C)。分析每个标签基因高表达和低表达对应HNC生存率的差异,发现cDC1、actDC和act-Macro基因集的高分与HNC的5年生存率增加相关。为了阐明cDC1、actDC和act-Macro与生存之间的关系,通过GSVA评估了TC中髓系腔室内的亚群的GO term(图5D),发现所有的树突状细胞,以及ISG单核状细胞,在抗原呈递途径上的得分都高于巨噬细胞。具体来说,cDC1簇在与MHC I交叉呈现相关的通路中得分最高,其次是ISG单核细胞、DC5和actDCs。相比之下,所有的DC集群在通过MHC-II的呈现中都展现出相似的分数,是高于Mono-Mac集群的。反过来,巨噬细胞簇的特征是与趋化、吞噬、ECM分解、血管生成和补体途径相关的基因表达更高。值得注意的是,ISG单核细胞在细胞对IFNG的反应和病毒生命周期的负调控中优先富集,这表明该簇的TME特异性极化。
通过外部数据集进行受体配体分析,以确定TC中主要的细胞-细胞相互作用,以及TC较HT过表达的受体-配体基因对。作者的分析集中在髓样细胞与T/NK细胞亚群的相互作用上,因为后者在TME中有很高的丰度(图5E,F)。与其他T/NK细胞相比,cDC1s的NK和组织驻留记忆(TRM)的CD8 T细胞具有更高的信号强度,其次是Treg亚群。此外,cDC1s通过XCL1/XCL2-XCR1以及CLEC2B-KLRB1与TRMCD8 T细胞、效应记忆(EM)CD8 T细胞和NK细胞相互作用。根据预测的信号强度,actDCs和act-Macro的相互作用比cDC1更多样化。actDCs和act-Macro都被预测通过NECTIN2-TIGIT与几个T/NK-亚群相互作用。
三、小结
HPV驱动的TC是以1型T细胞炎症反应为特征的HNC的一个亚群,作者使用单细胞测序数据绘制了HPV+扁桃体癌的髓系腔室。通过结合转录组分析、基因标记评分、调节子活性评估和RNA速率分析,获得了一个髓系腔室动态快照,说明了不同髓系亚群的相互关系。作者观察到HPV+扁桃体癌中髓系腔室的扩张,同时在DC和单核-巨噬细胞中均出现干扰素诱导的细胞反应。并且作者揭示了四种DC谱系的存在,两种巨噬细胞极化过程,以及它们的序列成熟谱,筛选出髓系中与HNC生存相关的基因。本文研究思路清晰深入,对HPV+扁桃体癌髓系亚群分析的很深入,这种研究方式也是十分值得我们学习的。
参考文献:Jimenez DG, Altunbulakli C, Swoboda S, Sobti A, Askmyr D, Ali A, Greiff L, Lindstedt M. Single-cell analysis of myeloid cells in HPV+ tonsillar cancer. Front Immunol. 2023 Jan 19;13:1087843. doi: 10.3389/fimmu.2022.1087843IF: 8.786 Q1 . PMID: 36741389; PMCID: PMC9893928.