随着单细胞测序数据的爆发式增长,对于不同细胞亚群之间互作及细胞通讯的解析成为研究者关注的热点。近期,一篇解读黑色素瘤肿瘤细胞和CD8+ T细胞之间的异质性串扰对临床影响的研究于2022年7月发表在Frontiers in Immunology杂志(IF:8.786)上。研究囊括细胞状态的从头识别,基于受体-配体互作系统解析肿瘤细胞与CD8+ T细胞的细胞通讯,并揭示出一组关键的细胞亚群互作对,能够影响患者的临床获益。分析流程环环相扣,可作为基于公共单细胞测序数据挖掘分析的参考。
Single-Cell Transcriptomic Analysis Reveals the Crosstalk Propensity Between the Tumor Intermediate State and the CD8+ T Exhausted State to be Associated with Clinical Benefits in Melanoma
单细胞转录组分析揭示肿瘤中间状态与CD8+ T细胞耗竭状态的互作倾向性与黑色素瘤临床获益相关
黑色素瘤中肿瘤细胞和CD8+T细胞的互作异质性导致了不同患者免疫治疗临床获益的巨大差异。先前研究揭示出肿瘤微环境细胞的空间分布和功能状态具有高度异质性。而黑色素瘤中,肿瘤细胞和CD8+T细胞之间是否存在串扰倾向,以及这种串扰倾向如何影响患者的临床预后尚不清楚。本研究利用公开的单细胞转录组数据,在黑色素瘤中发现了肿瘤细胞和CD8+T细胞的异质性功能状态和他们之间广泛的配体-受体互作。此外,基于细胞间通信强度和细胞状态活性之间的关联,作者确定了肿瘤中间状态和CD8+T细胞耗竭状态之间的串扰倾向。这种串扰倾向通过伪空间接近性、空间共定位和细胞内/细胞间信号转导网络进一步得到了验证。在样本水平上,肿瘤中间状态和CD8+T细胞耗竭状态的互作预示着患者的预后更好,而在免疫治疗耐药患者中观察到两者均减少。此外,基于这两种细胞状态确定的风险群体呈现肿瘤基因组突变和抗肿瘤免疫反应状态的差异。作者的研究强调了肿瘤中间状态和CD8+T细胞耗竭状态之间的串扰倾向,这可能为指导患者风险分层、预后标志物的开发和潜在治疗靶点的开发提供参考。
二、研究背景
皮肤皮肤黑色素瘤(SKCM)是最致命的皮肤恶性肿瘤,具有高突变负荷和增加的细胞可塑性,肿瘤间和肿瘤内的异质性较高。最近,多篇研究证实了黑色素瘤中存在肿瘤细胞(3,4)和CD8+T细胞(4-6)的不同表型和转录亚群,通常被称为不同的细胞状态。MITF(黑素细胞诱导转录因子)-变阻器模型揭示了黑色素瘤中发现的六种不同的表型状态。这些细胞状态根据MITF活性从高到低依次排列为高分化状态、黑素细胞状态、中间状态、饥饿状态、神经嵴干样细胞状态和间充质样状态(7)。肿瘤内CD8+T细胞群在三个独立的黑色素瘤队列中显示出相似的异质性亚群,包括初始/记忆,细胞毒性,过渡状态和耗竭状态的CD8+T细胞亚群。对细胞状态异质性的分析对探究不同细胞状态的机制以及细胞状态如何影响黑色素瘤的进展,如转移和治疗反应至关重要。
三、研究主要内容及结果
1.从头推断肿瘤及CD8 T 细胞的状态亚群
根据以往研究(3)中与肿瘤细胞状态相关的转录调控状态的单元(regulons, Table S1),利用AUCell算法计算2018个肿瘤细胞的调控活性得分谱,并进行无监督的一致性聚类分析,识别了4种细胞状态(图1A)。不同肿瘤细胞状态可以在黑色素瘤患者中共存(图1B),这种现象已在多个研究中报道过(4,1 3)。黑素细胞状态表现出谱系特异性转录因子的调控活性的升高(如SOX10和MITF)和显著升高的色素沉着和增殖潜能(图1A、C、D)。与黑素细胞状态相比,间充质样状态失去了黑素细胞转录因子的调控活性,但具有显著的更高的干性和侵袭潜能(图1A,E,F)。大部分肿瘤细胞处于中间状态,受EGR3、NFATC2和SOX6的调控(图1A)。
进一步,识别1759个CD8+T细胞样本中前2000个高变异基因,并基于这些基因的表达矩阵进行主成分分析(PCA)。基于R包Seurat的FindClusters函数识别了6个CD8+ T细胞亚群,并进行UMAP可视化。然后结合先前报道的(25)(Table S1)和FindAllMarkers函数识别的细胞状态标记基因对CD8+T细胞亚群进行状态注释。同时,基于前2000个高变异基因,应用Monocle2算法,构建不同 CD8+ T细胞亚群的发育轨迹。
C1亚群标记为耗竭状态,高表达耗竭标记物(如HAVCR2、PDCD1和LAG3)和细胞毒性相关基因(如GZMB、PRF1、GZMA和NKG7)。C2亚群被定义为一种过渡状态。C3亚群富集初始/记忆T细胞相关基因(例如IL7R、CCR7、SELL和 TCF7)。上述三个主要细胞亚群的状态定义与轨迹分析中的进展过程相一致(图2D)。此外,还有其他三个较小的亚群。这些CD8+ T细胞亚群在每个患者中所占的比例也不同(图2E)。
2.基于配体-受体互作刻画肿瘤及CD8 T 细胞的串扰景观
整合5个已发表资源中的人类配体-受体对(Table S2)。这些注释资源被用来推断候选的细胞状态特异性配体-受体互作,以构建肿瘤-CD8+ T细胞互作组(图S1B, C),并形成配体-受体互作网络(图S2A)。肿瘤细胞表达了相对高水平的与抗原呈递和TGF-信号通路相关的趋化因子和配体,而相应的受体在CD8+ T细胞中广泛表达,这表明这些配体在诱导黑色素瘤免疫细胞浸润中可能发挥了重要作用(图3A)。相反,配体IFNG 及其相关的CD8+ T细胞中表达了促炎细胞因子TNF以及与肿瘤坏死因子家族和细胞毒性相关的配体,表明CD8+ T细胞对肿瘤细胞的杀伤潜力。值得注意的是,在所有细胞状态中,无论肿瘤细胞作为发送者还是受体,中间状态肿瘤细胞具有最多的配体-受体互作(图3B,C,S1D)。这些结果表明,中间状态肿瘤细胞和神经嵴样肿瘤细胞可能更频繁地与CD8+ T细胞发生串扰。
3.解读肿瘤及CD8 T 细胞之间的串扰倾向性
为了进一步识别细胞状态特异的配体-受体互作,作者首先应用NicheNet方法(41)计算每个信号接收细胞的配体活性(图4A,B)。当肿瘤细胞作为受体时,不同肿瘤细胞状态下某些配体的活性存在明显差异,如中间肿瘤细胞状态接受最强的配体IFNG信号(图4A,C)。但CD8+ T细胞中这种现象不太明显。
使用与细胞状态相关的配体作为介质,进一步探索了细胞通讯和细胞状态之间的关系。发现肿瘤中间状态细胞和CD8+T耗竭状态之间具有显著过出现的配体,并且观察到观察到肿瘤细胞对CD8+ T细胞发送信号(超几何检验,p<0.001),说明肿瘤中间状态细胞可能通过这些配体影响CD8+ T耗竭状态细胞。
4.验证肿瘤中间状态与CD8+ T耗竭状态之间的串扰倾向
细胞的功能经常会受到邻近细胞的影响。作者随后利用CSOmap算法重建肿瘤细胞和CD8+T细胞的三维伪空间(图5A),从空间角度验证这种串扰倾向。在伪空间中,紧密连接结构(tightly linked structures)的主要部分是由耗竭的CD8+T细胞和中间状态肿瘤细胞构成的(图5B和C),并在肿瘤细胞和CD8+T细胞的边界处紧密连接(图5D)。而且,耗竭的CD8+T细胞和中间状态肿瘤细胞的整体互作细胞对最多(图5E),表明它们在的伪空间接近性。伪空间接近性主要是由抗原呈递和趋化因子相关的配体-受体相互作用引起的,如HLA-B-CANX和CXCL10-CXCR3(图5F)。有趣的是,在一个黑素瘤微区测序数据(MEL1-1)中,在黑素瘤侵袭边界呈现显著增加的耗竭CD8+T细胞和中间状态肿瘤细胞(ssGSEA score, 图5G-I)。此外,在黑素瘤样本的空间转录组数据中,发现部分空间spot同时富集了耗竭的CD8+T细胞和中间状态肿瘤细胞(ssGSEA score, 图5J,K)。这些结果表明耗竭的CD8+T细胞和中间状态肿瘤细胞的空间共定位。
为了进一步研究哪些分子可能介导肿瘤中间状态和CD8+T耗竭状态之间的串扰倾向,作者构建了一个细胞间/细胞内信号转导网络(TF-配体-受体-TF),并发现了多种信号通路参与其中(图6A)。部分信号转导过程进一步支持细胞通讯与细胞状态之间的联系。例如,PRDM1可以调节CD8+T耗竭细胞分泌的IFNG配体的表达水平,并与中间肿瘤细胞上的IFNGR1/IFNGR2受体结合,进而激活下游的间充质相关转录因子,如FOS和NR3C1。随后利用TCGA-SKCM和GDSC数据验证他们的关联关系。
总之,这部分通过伪空间接近性、空间共定位和信号转导网络三个方面验证了肿瘤中间状态和CD8+T耗竭状态之间的串扰倾向。
肿瘤中间状态与CD8+ T耗竭状态与临床获益相关
随后,作者探讨了这种串扰倾向是否与患者的临床获益相关。COX比例风险回归模型(COX-PH)和生存曲线分析表明,肿瘤中间状态和CD8+T耗竭状态都能显著区分患者的总体生存(OS)以及无进展间隔(PFI)(图7A-C)。而且,两个指标都高的患者的OS显著更长(图7D)。此外,作者进一步评估肿瘤中间状态和CD8+T耗竭状态在免疫治疗应答中的作用。作者发现在TCGA-SKCM队列中,IFN-gama反应与肿瘤中间状态和CD8+T耗竭状态的ssGSEA评分之间存在显著正相关(中间状态:R=0.46,p<2.2e-16;耗竭:R=0.62,p<2.2e-16)(图7E)。在anti-PD1在治疗队列中,应答者的CD8+T耗竭状态评分显著高于无应答者(图7I)。综上所述,在免疫治疗耐药样本中,肿瘤中间状态和CD8+T耗竭状态与良好的预后协同相关。
风险群体的基因组突变和免疫特征刻画
根据上述生存分析,我们将TCGA-SKCM队列分为高低风险组,其中低风险组对应肿瘤中间状态较高、CD8+T耗竭状态得分较高的样本。作者首先探究了风险分组与先前定义的免疫亚型的关联。对于泛癌免疫亚型,C2-interferon-gamma显性亚型在低风险组中占显著优势,而高风险组在C1-伤口愈合和C4-淋巴细胞缺失亚型中富集(图8A)。作者还观察了风险分组与先前定义的突变分子亚型之间的关联。结果表明,风险分组跨越了不同的突变分子亚型,且在不同分子亚型的分布上没有显著差异(图8B)。
作者进一步研究了低风险和高风险人群之间的基因组和免疫特征的差异。BRAF在样本中发生高频突变,且突变率在低风险组中显著高于高风险组(突变频率分别为59.4%和45%,p=0.006)。这与先前观察的BRAF突变亚型在高低风险组的分布一致,预示了更长的生存(图8C,D)。与低风险组相比,细胞粘附相关的VIT基因仅在高风险组中发生突变(突变频率分别为6.3%和0%,p=0.0009,图8E)。此外,在免疫浸润方面,低风险组的抗肿瘤免疫反应相关淋巴细胞浸润明显升高,如CD8+ T、CD4+ T和活化的NK细胞(图8F)。综上所述,低风险组具有较高的BRAF突变和较强的抗肿瘤免疫反应,提示风险分组能够反映肿瘤基因组信息和抗肿瘤免疫微环境特征。
文章基于通过公开的scRNA-seq数据识别了肿瘤细胞和CD8+ T细胞的不同状态亚群,发现并解读了肿瘤中间状态和CD8+ T耗竭状态之间的串扰倾向以及对临床预后的潜在应用价值。