各位小伙伴，大家好呀！ 今天给大家带来的是一篇基于单细胞RNA测序数据分析人类胃癌器官特异性转移转录异质性的文章；文章分析思路整体来说都是偏常规的分析，但是亮点在于作者将肿瘤微环境中的每一种免疫细胞都进行了细致入微的刻画，非常适合大家在分析数据时开拓自己的思路，快来和小编一起看看吧~

研究背景

胃癌(GC)是全球第二大癌症死亡原因，每年有103万例，而亚洲胃癌发病率最高，占全球病例的70%。大多数GC患者被诊断为晚期和转移期，再进行药物治疗时往往患者已经产生了耐药性，因此，手术治疗已经不再是治疗胃癌的唯一方式。

肿瘤细胞可通过血液、淋巴系统和腹腔内扩散侵入远处部位以进行转移，在转移过程中，肿瘤细胞通过激活特定的基因和通路，向特定的器官进化适应度并表现出趋向性，不同器官的转移是胃癌诊断和治疗面临的最困难和最紧迫的问题。因此，精确绘制器官特异性转移特征是至关重要的，特别是对于不同转移的特异性治疗策略的开发以及临床诊断的潜在生物标志物的识别。然而，胃癌向不同器官转移的特点在很大程度上尚不清楚。

因此，作者收集了包括转移和肺转移共6名胃癌患者进行单细胞RNA测序，刻画了胃癌患者肿瘤间和肿瘤内部微环境异质性的问题，更好地分析了胃癌不同器官转移的模式。

二、主要结果

Result1: 刻画原发性和转移性GC的单细胞转录图谱

作者对6名患者的10份新鲜人体组织样本进行了scRNA序列分析，包括三份原发肿瘤样本（PT；即PT1、PT2和PT3）、一份相邻的非肿瘤样本（NT；即NT1）和六份转移样本（M）。在转移样本中，作者在胃镜检查、活检或手术切除中获得了两个肝转移样本（Li：即Li1和Li2）、两个淋巴结转移样本（LN：即LN1和LN2）、一个腹膜转移样本（P：P1）和一个卵巢转移样本（O：O1）。其中，PT1和Li1来自患者1；PT2和NT1来自患者2；O1来自患者3；PT3、Li2和LN1来自患者4；LN2来自患者5；P1来自患者6。PT1、PT2、PT3、Li1、Li2、LN1和P1是肠道组织学GC样品，而LN2和O1是组织混合型GC样本。

在经过质量筛选后，作者共检测到42968个细胞以用于下游分析（图1A、B）。在进行降维和聚类以及运用Marker基因进行细胞注释后共确定了七种细胞类型，分别为上皮细胞、基质细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤细胞和髓系细胞等（图1C）并展示了注释每种细胞类型所运用到的Marker（图1D、E）。作者对不同的细胞类型进行数目上的统计，发现由于不同细胞类型的分离效率不同，免疫细胞在所有样本中所占比例最大（90.4%），尤其是淋巴结和肝脏。

最后作者对于原发性肿瘤和转移性肿瘤进行了分析，发现每种细胞的比例差异很大（图1F），揭示了转移性肿瘤与原发性肿瘤相比较肿瘤间的异质性。

图1：GC原发肿瘤、转移灶和邻近非肿瘤样本的单细胞转录组谱

Result2:恶性上皮细胞的四个亚群特征与肿瘤转移和生存时间的关系

作者借鉴之前发表在GUT文章上面的一个工作，通过计算每个恶性细胞中的肿瘤患者差异基因的表达丰度（score值）以此定义每个细胞的恶性程度。运用该方法作者共识别到1615个恶性细胞和128个非恶性上皮细胞。其中大部分的非恶性上皮细胞来自NT（图2A）。此外，作者发现与非恶性上皮细胞相比，恶性上皮细胞中几种肿瘤特异性基因（CLDN4、CLDN7、TFF3）的表达显著上调，而非恶性上皮细胞强烈表达与胃粘液和消化酶分泌相关的几个基因（MUC5AC、GKN1、PGC、LIPF），验证了注释细胞恶性程度的准确性。接着作者对PT和M样本中恶性细胞进行聚类分析，共显示了四个亚聚类G0-G3（图2B），同时对不同样本以及不同转移瘤中检测到恶性细胞的数目进行统计以展示恶性细胞的转录异质性（图2C）。接下来，作者进一步通过功能分析等定义每个恶性细胞亚群的潜在功能。

具体来说：作者发现血管生成的关键因子（VEGFA）在G0细胞中显著上调（图2D），运用IPA(Upon Ingenuity pathway analysis)分析，发现G0显著富集于血管内皮细胞的血管生成和粘附等信号通路（图2E）。恶性细胞亚群G1特异性表达上皮-间充质转化（EMT）相关基因SRGN、VIM和LAPTM5A，说明恶性细胞亚群G1具有上皮间质转化的功能（图2E）。恶性细胞亚群G2主要存在于LN3和PT患者中（图2C）。作者在进行IPA分析后发现G2细胞中的p53信号被激活，这将诱导细胞凋亡并抑制肿瘤生长。因此，G2细胞可能在GC患者中的呈现休眠状态。恶性细胞亚群G3细胞主要见于PT和M样本中。在G3细胞中，肿瘤恶性相关基因RASD1、PIK3R1、JUN和FOS显著上调（图2D），SPINK1癌症途径和HGF信号通路被激活，表明G3促进GC的恶性进展。生长因子途径对EMT的调节也显著增强（图2D），且E M T相关基因（ZEB2、VIM和ID2）显著上调，表明G3细胞中诱导了EMT进展。同时作者发现与恶性上皮细胞的其他亚群相比，G3中CD44（图2F）、PROM1（CD133）、LGR5等癌干细胞（CSCs）标记物的表达也显著上调，说明肿瘤干细胞在癌细胞增殖、迁移和转移中发挥重要作用。

之后，作者运用Monocle进行细胞拟时序分析，可以看出恶性上皮细胞的动态特征和异质性（图2G）。具体而言，在最初阶段作者观察到具有EMT诱导的CSC表型的G3细胞，随后是G1细胞。休眠样细胞G2和促血管生成G0细胞位于不同的轨迹分支，意味着恶性细胞进入了不同的分化状态。

最后作者进一步使用来自TCGA胃腺癌数据集，进行恶性细胞亚群特征基因的生存分析：我们发现高表达G0、G1、G3特征基因的患者预后较差(图2H-J)。

图2：胃癌中恶性上皮细胞的四个亚群及其与转移相关的特征

Result3: 细胞T和B细胞在GC进展过程中介导各种免疫反应

作者通过细胞Marker基因注释后共获得24 448个T细胞，进一步降维聚类获得11个亚群。其中包括5个CD8⁺亚群、5个CD4⁺亚群和1个未知亚群(图3A、3B)。

CD4⁺亚群由naive CD4⁺ T细胞，调节性T细胞(Tregs)，耗竭CD4⁺ T细胞，效应记忆CD4⁺ T细胞(CD4⁺ TEM)和GADD45B⁺ Th1 CD4⁺ T细胞组成。CD8⁺亚群由naive CD8⁺ T细胞，细胞毒性CD8⁺ T细胞(GNLY, GZMB)，耗竭CD8⁺ T细胞，效应记忆CD8⁺ T细胞和mucosal-associated invariant T细胞 (MAIT)组成（图3A）。

如图3B所示，肿瘤样本(PT和M)中CD4⁺ T细胞和treg细胞的耗散程度较高，而M中CD4⁺ TEM、CD8⁺ TEM和细胞毒性CD8⁺ T细胞的比例与NT相比如预期的略有降低，表明肿瘤进展和转移过程中产生了免疫抑制情况。此外作者通过比较不同种类的样本中的MAIT细胞比例，发现在转移样本（M）中，MAIT细胞不表达GZMB（编码一种可以杀死感染细胞的蛋白质）但高表达KLRG1（T细胞功能失调相关的基因）(图3C)，与生物学先验知识背景相呼应。免疫荧光染色显示，在PT和M中均可观察到MAIT细胞，在M中数量较多(图3D)。

为了识别T细胞亚群的特征并分析他们之间的关联，作者进一步进行了细胞通讯的分析，检测细胞毒性/耗竭性CD8⁺ T细胞和NK细胞中KLRC1/KLRC2的表达水平：作者发现在肿瘤内CD8⁺ T细胞和NK细胞中KLRC1表达均上调，同时细胞通讯分析还预测了每个患者不同细胞类型中HLA-E-KLRC1/KLRC2受配体的表达丰度 (图3E)。作者进一步将不同患者的CD8⁺ T细胞中的PDCD1表达与检查点阻断治疗进行关联分析，以此推断TIGIT和LAG3为患者1，2，5，6的共抑制受体(图3F)。接着，作者对7708个B细胞进行细胞亚群的注释，共注释为5个B细胞亚群（图3G），不同样本中B细胞类型的比例差异很大（图3H），表明胃原发肿瘤和不同转移灶中肿瘤微环境中的免疫异质性问题。最后在本研究中，作者发现了一种细胞类型并命名为T细胞样B细胞（T cell like-B cell），在M中表达最高，T cell like-B cell相关DEGs的通路分析显示，白细胞/淋巴细胞的结合和NK细胞/淋巴细胞的细胞毒性显著增强，说明T cell like-B cell与其他细胞亚型的相互作用(图3I)。

图3：GC进展过程中由T和B细胞介导的各种免疫反应。

Result4：内皮细胞促进血管生成并产生免疫抵抗

在本研究中，399个细胞被鉴定为内皮细胞，其典型标记基因表达一致。对其降维聚类后共分为4个亚型，分别为E0-E3(图4A)。其中E0细胞在PT和M中特异性表达IGFBP5、STC1和IGFBP3，而在NT中不表达IGFBP3(图4B)。促血管生成因子VEGFA和TGF-β是IGFBP5的上游调控因子。IPA显示，与胃癌中肿瘤侵袭密切相关的mTOR和IGF-1信号在E0细胞中均被正调控，因此作者定义E0细胞亚群可能增加肿瘤细胞的侵袭和迁移(图4C和D)。同时，IPA还显示E1细胞与T细胞衰竭信号通路的调节密切相关(图4D)。E2细胞在NT细胞中占比最高(88%)，其活性低于其他三个亚群，在本文章定义为正常内皮细胞(图4C和D)。E3细胞中白色脂肪组织褐变通路被激活，其中VEGF受体编码基因NRP1和成纤维细胞生长因子受体编码基因FGFR1表达显著上调(图4D)，因此定义E3细胞亚群为参与血管生成的细胞亚群。最后作者又运用TCGA胃癌的队列数据进行验证，进一步说明高表达E1和E3细胞亚群特征的患者的预后较差(图4F)。

图4：内皮细胞促进GC血管生成并产生免疫抵抗

Result5：炎性癌成纤维细胞(iCAFs)与GC生长和侵袭有关

作者将889个成纤维细胞无监督聚类为两个不同的亚型(图5A-5C)。其中F0（高表达PDGFRA和CXCL12）是主要的成纤维细胞类型，在PT和M占比较高(图5D)：高度表达RGS5和ACTA2，类似于膀胱尿路上皮癌中描述的iCAFs。F1细胞 (图5D)被鉴定为肌癌相关成纤维细胞(mCAFs)。与F0类似，F1细胞在不同样品中的比例差异较大(图5B)。作者通过GO进行功能富集分析，发现iCAF和mCAF均富集于细胞外基质和细胞-底物粘附富集这一功能；但mCAFs特异性富集于肌肉相关过程；而iCAF则富集于细胞外基质分解、白细胞迁移调节、以及细胞生长和血管生成的调节(图5E)。MMP2和MMP14被认为促进细胞外基质降解和肿瘤细胞侵袭的基因，这两个基因主要在iCAFs中表达，影响top富集的生物功能(图5F)，并能促进细胞外基质降解和肿瘤细胞侵袭。CXCL12也是iCAFs中的特异性标记物(图5D)，其在CAFs中的高表达可促进GC细胞侵袭和EMT。为了确认iCAFs是否能调节细胞生长和血管生成，作者进一步分析了iCAFs和mCAFs中各种生长因子编码基因(VEGF、IGF、FGF家族)的表达 (图5G)，提示iCAFs可以促进GC肿瘤生长。最后通过细胞通讯分析(图5I)，配体-受体对CXCL12-CXCR4参与了iCAFs与T、B或髓系细胞之间的相互作用，经过文献证实这是GC中免疫抵抗的一种机制。最后，作者将iCAF与生存进行关联分析，发现与低表达患者相比，高表达iCAF特征基因的患者患者的总体生存率更差（p<0.05），进一步验证了iCAF与细胞生长和血管生成相关这一结论。(图5H)

图5：CAF可在GC的TME中识别，并与肿瘤侵袭相关。

Result 6: GC中髓细胞谱系的多样性

作者通过无监督聚类和细胞marker基因的注释，共确定了1801个单核吞噬细胞系统细胞（326个树突状细胞（DC）、894个巨噬细胞和581个单细胞）、139个肥大细胞和3579个中性粒细胞（图6A）。作者进一步对每种细胞亚群又进行了细分，其中树突状细胞DC被重新分类为经典DC1（cDC1）、经典DC2（cDC2）、浆细胞样DC（pDCs）和活化DC，经过分类别的数量统计，cDC1和cDC2在PT和M中富集，而NT中活化DC的比例较大（图6B）。有趣的是，在NT中很少发现pDC，但在LN和一些PT中出现，分析原因为pDC高度表达颗粒酶基因GZMB和白细胞免疫球蛋白样受体家族基因LILRA4和LILRB4，低表达CD86、CD80、CD83和LAMP3等基因，因此显示出免疫抑制表型（图6C）。

作者对Ma0-Ma3四个巨噬细胞亚群计算之前较为常见的M0和M1打分，进一步对巨噬细胞进行了详细的划分(图6D和E)。Ma0聚集在PT中，高表达的诱导血管生成和癌细胞迁移的重要巨噬细胞基因VEGFA和SPARC(图6F)，说明Ma0可能是一种与血管生成相关的巨噬细胞类型。Ma1细胞表达的DEGs包括HLA-DPB1和HLA-DPA1 (MHC-II)(图6F)，它们与促炎表型相关。Ma2中FABP5高表达显示其与免疫抑制密切相关。

单核细胞分为两种已知类型，CD14+CD16（FCGR3A）− 经典单核细胞亚型Mo1和Mo3和CD14+CD16+细胞亚型Mo0和Mo2(图6G-I)。PT含有大量Mo0、Mo1和Mo3单核细胞。相反，M特别是O和Li在Mo2细胞中富集（图6H）。IPA显示Mo2细胞具有增强肿瘤细胞吞噬和细胞死亡的功能，因此，Mo2细胞可能对肿瘤细胞产生细胞毒性作用。

中性粒细胞亚簇显示六个簇（图6J和K）。其中LYZ编码的溶菌酶是Paneth细胞分泌的一种抗菌肽，与自噬和维持免疫稳态有关。作者同时进行了IPA分析，富集结果显示N0细胞吞噬功能增强（图6L），并进行实验验证，通过RNAscope和标记基因LYZ和NAMPT进一步证实了GC中存在Paneth样细胞（图6M）。同时作者对髓源性抑制细胞（MDSC）进行了进一步亚型的划分，进一步刻画了胃癌患者肿瘤异质性的问题。

图6：GC进展期髓样细胞的富集情况

Result 7:淋巴结源性耗竭性CD8⁺T细胞的20个基因特征被证实可以预测淋巴结转移

肿瘤浸润性T细胞和B淋巴细胞在癌症发展和转移中起着关键作用；了解这些免疫细胞在不同器官GC转移中的浸润状态，可以为器官特异性转移制定特定的诊断和治疗策略。作者采用无监督方法对T细胞和B淋巴细胞的每个亚群进行重新聚类，探讨GC中淋巴细胞的器官特异性转移特征。如图7A TSNE降维结果所示，在大多数T细胞亚群和一些B细胞亚群中，不同的器官转移在转录上是异质的（每一种疾病样本类型中包含不同的亚型）。

早期GC中，淋巴结转移的发生率极高，在单细胞分辨率下识别淋巴结转移的特征具有重要意义。因此，作者通过差异分析，识别了20个（top 20）GC中生成淋巴结衍生（lymph node-derived）T细胞和B细胞亚群的基因表达特征并为每个淋巴结衍生的T细胞和B细胞亚群添加了20个基因标签。如图7B所示，在耗竭性CD8⁺T细胞中，淋巴结衍生亚群中前20个上调的DEG在LN中的表达高于其他转移瘤，同时与其他原发肿瘤相比，PT3（淋巴结转移患者的原发肿瘤样本）中的表达也更高，表明20个基因特征可以反映从原发部位向淋巴结转移的模式；作者进一步将20个signature与患者的预后进行关联，说明了这20个signature对于患者生存时间的影响（图7D）。

图7：不同器官转移的T和B淋巴细胞亚群异质性探究

自此这篇文章的主题内容就介绍完毕啦，总体来说，作者对胃癌特异性器官转移的6名患者进行了单细胞RNA-seq测序，通过对肿瘤微环境中每种细胞类型的刻画，识别了胃癌患者中，原发肿瘤和器官转移的异质性问题，结合TCGA组学数据进一步进行了验证；最终识别到了可以作为胃癌特异性性器官转移的肿瘤浸润性T细胞和B淋巴细胞的signatures。整体的文章思路清晰，尤其是在GC肿瘤微环境中免疫细胞的刻画上细致入微，可见，数据量并不是发好文章的唯一法宝，与生物学意义紧密结合，也同样可以尽显工作的意义。