小伙伴们，大家早上好，今天和大家分享的文献是近期发表在《Respiratory Research》（IF：7.16）杂志上，本文通过生信分析和基因敲除的验证，全面分析了CENPO在泛癌中的作用，思路清晰，让我们一起学习吧！！

Pan‑cancer landscape of CENPO and its underlying mechanism in LUAD

摘要

着丝粒蛋白O (CENPO)是一种新发现的组成性着丝粒蛋白，与细胞死亡有关。然而，关于CENPO表达如何与人类癌症或免疫浸润相关，我们知之甚少。本文作者通过体外和体内实验评估了CENPO在泛癌中的作用，并进一步验证了在肺腺癌(LUAD)中的结果。

癌症缩写：

BLCA：膀胱移行细胞癌；BRCA：乳腺浸润性癌；CESC：宫颈癌和子宫颈癌；CHOL：肝胆管型肝癌;COAD: 结肠腺癌;ESCA: 食管癌;GBM: 多形性胶质母细胞瘤;HNSC: 头颈部鳞状细胞癌;LIHC: 肝细胞癌;LUAD：肺腺癌;LUSC：肺鳞癌;READ:直肠腺癌；STAD: 胃腺癌;UCEC:子宫内膜癌

1.CENPO在各种人类癌症中的上调

首先，利用GTEx数据库分析CENPO的表达情况，在大多数正常人体组织中，可以检测到CENPO mRNA的表达水平(图2A)。CENPO基因在正常人EBV转化淋巴细胞、睾丸、胫骨神经、培养成纤维细胞、皮下脂肪组织、子宫颈，卵巢中高表达（图2B）。利用Sangerbox数据库研究泛癌中CENPO的表达水平，CENPO在大多数癌症中上调，但是在甲状腺癌(THCA)和肾嫌色细胞癌(KICH)中下调。作者使用TIMER 2.0数据库分析了TCGA数据集中的CENPO表达。发现CENPO在大多数癌症中上调(图2C)，包括BLCA、BRCA、CESC、CHOL、COAD、ESCA、GBM、HNSC、LIHC、LUAD、LUSC、前列腺腺癌(PRAD)、READ、STAD和UCEC。但是在KICH、THCA和肾乳头状细胞癌(KIRP)中也呈负性调节(图2C)。此外，与相应的正常样本相比，在配对的肿瘤样本中，分别有23种癌症的CENPO表达显著增加(图2D)。作者又分析了CENPO与GEPIA2网站上的泛癌阶段之间的关系，发现CENPO与肾上腺皮质癌(ACC)、BRCA、KICH、KIRP、LIHC、LUSC、OV和LUAD的分期显著相关(图2E)。这些结果表明，CENPO在各种类型的癌症中表达上调，表明CENPO可能在癌症诊断中发挥潜在的关键作用。

2.CENPO在泛癌中的诊断和预后作用

利用ROC曲线评估了CENPO对多种类型癌症的诊断，CENPO可以作为一些癌症很好的预后标记物（图3A）。此外，CENPO水平的增加与ACC 、KICH、LIHC、LUAD、肉瘤、葡萄膜黑色素瘤、LGG、SKCM和间皮瘤较差的生存相关（图3B）。相比之下，在READ中，CENPO表达增加与更好的OS相关 (图3B)。此外，DFS结果还显示，在ACC、KICH、LIHC、LUAD、SARC、UVM、LGG、SKCM和MESO (p = 0.08)中，CENPO表达增加与预后较差相关（图3C）。

3.CENPO参与泛癌的免疫浸润

作者评估了泛癌中ESTIMATE评分和CENPO表达之间的关系，在一些癌症中，CENPO表达与ESTIMATE、免疫和基质评分呈负相关（图4A）。表明在一些肿瘤中，CENPO的高表达与免疫细胞和基质细胞浸润减少有关，从而导致肿瘤纯度高。相反，有一部分癌症中，CENPO表达与ESTIMATE、免疫和基质评分呈正相关(图4A)。然后作者利用Sangerbox数据库研究了不同肿瘤中CENPO表达与肿瘤中浸润免疫细胞水平之间的关系，CENPO表达与免疫细胞之间的关系在不同类型的肿瘤中有很大的差异，这取决于免疫细胞的类型（图4B）。

还研究了CENPO表达水平与肿瘤突变负荷（TMB）、微卫星不稳定性（MSI）或MATH之间的关系，以确定CENPO是否是多种癌症免疫治疗反应的预测因子。在一些癌症中，CENPO表达与TMB呈正相关（图4C）。此外，有一部分癌症，CENPO的表达与MSI呈正相关，而在GBML 、KIPAN和PRAD中与MSI呈负相关。(图4D)。一部分癌症中，CENPO的表达与MATH呈正相关，而在另一部分中与MATH呈负相关(图4E)。

免疫检查点(ICP)封锁蛋白是最有希望的癌症免疫治疗靶点。因此，作者分析了在多种癌症类型中ICP基因表达水平与CENPO的关系。在大多数肿瘤中，CENPO表达与ICP基因呈正相关。在THYM中，CENPO表达与大多数ICP基因呈负相关（图4F）。

综上所述，CENPO在泛癌的免疫浸润中发挥重要作用，可能成为肿瘤治疗中的一个新的免疫治疗靶点。

使用TIMER 2.0研究了CENPO在免疫细胞浸润中的潜在作用，发现大多数肿瘤中，髓源性抑制细胞(MDSC)浸润水平与CENPO表达显著正相关(图5A); 排在前6位的肿瘤分别为ACC、ESCA、LIHC、LUAD、READ和UCEC (图5B)。在大多数肿瘤中T细胞NK的浸润水平与CENPO的表达呈负相关(图5C); 排在前6位的肿瘤分别为BRCA-Her2、CHOL、PRAD、SARC、THCA和THYM (图5D)。

通过TISIDB数据库进一步分析了CENPO与趋化因子和趋化因子受体的关系，发现CENPO的表达与大多数趋化因子呈负相关(图6A)。图6B显示了18种趋化因子受体与CENPO表达的相关性，并观察到在LUAD中，CENPO与3种趋化因子受体呈负相关。CENPO表达与大多数组织相容性复合体(MHC)呈负相关，对于LUAD, CENPO表达与12种MHCs呈负相关。

4.LUAD中CENPO突变的特点

作者分析了TCGA队列中CENPO突变状态，在32种癌症中观察到CENPO改变，其中子宫癌的发病率最高（图7A）。图7B还显示了CENPO突变位点、类型和数量。然后在TCGA-LUAD数据集上分析CENPO表达与体细胞突变和拷贝数变异(CNVs)等特定基因组特征之间的关系。CENPO^high组显示TP53、TTN、CSMD3、MUC16和ZFHX4基因的高频率体细胞突变，CENPO^low组显示TP53、MUC16、TTN、CSMD3和RYR2的高频率突变(图7C)。

5.CENPO在LUAD中的功能分析

通过LinkedOmics数据库探讨了CENPO在LUAD中的生物学功能，前50个基因与CENPO呈正相关和负相关的基因如图所示（图8A-C）。GO分析结果显示CENPO主要涉及DNA依赖的DNA复制、DNA复制、细胞周期相变、细胞周期过程等(图8D)。KEGG分析显示在细胞周期、DNA复制、剪接体、蛋白酶体、药物代谢等方面富集(图8E)。CENPO与前两个显著富集的信号通路(包括细胞周期和DNA复制)的相关性，其中CENPO与细胞周期蛋白(包括CDK1、CCNA2、CCNB1、CCNB2、CCNEA、CCNE2和CDKN2A)显著相关(图8F)。表明CENPO可能在LUAD的细胞周期调控中发挥关键作用。

6.LUAD中调节CENPO表达及相互作用基因的ceRNA网络的构建

lncRNAs调控mRNA的表达，在肿瘤发生中发挥重要作用。作者构建了LUAD中可能调控CENPO的表达lncRNA-miRNA网络。根据miRDB、miRWalk、Targetscan和miRabel数据库，确定了82个可以靶向CENPO的miRNAs(图9A)。又分析了在TCGA-LUAD中与患者生存显著相关miRNAs，得到了43个miRNAs。在两组的交点只有miR-370(图9B)。表明hsa-miR-370可以靶向LUAD中CENPO的表达。通过LncBase数据库识别到了61个可以靶向hsa-miR-370的lncRNA，其中只有10个lncRNA与LUAD患者的预后显著相关(图9D)。利用83个miRNA和10个lncRNA构建lncRNA-miRNA-CENPO调控网络(图9C)。基于HALLMARK的前5个正向富集的通路是“E2F靶标”、“G2M检查点”、“有丝分裂纺梭体”、“mtorc1信号通路”和“MYC靶标”(图9E)。KEGG富集结果，最显著的正富集途径是细胞周期，而最显著的负富集途径是哮喘、药物代谢细胞色素P450、肠免疫网络生成Ig A和视黄醇代谢(图9F)。

利用CancerSEA的单细胞序列数据分析了CENPO和18种癌症的功能状态之间的关联。CENPO与大多数癌症的细胞周期、DNA损伤和DNA修复呈正相关(图10A)。CENPO与大多数癌症的缺氧和血管生成呈负相关(图10A)。在LUAD中，CENPO表达与细胞周期(、DNA损伤、DNA修复、侵袭、增殖显著正相关(图10B)，与炎症负相关(图10B)。p = 0.0016)和分化 (图10C)。

7.CENPO下调可诱导LUAD细胞凋亡和G2阻滞

上述的生信分析发下CENPO与细胞周期显著相关，作者利用GEPIA2.0数据库分析CENPO和CDK家族和Cyclin家族之间的关系，发现CENPO与CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、CCNA、CCNB、CCNC和CCNE呈正相关(图11A)。通过细胞系的培养和敲除发现，CENPO的沉默显著诱导细胞凋亡(图11B)和G2的阻滞(图11C)。

综上所述，CENPO敲除的LUAD细胞可诱导细胞凋亡，阻滞周期为G2/M期。

8.CENPO基因敲除通过mTOR信号通路抑制LUAD细胞生长和转移

作者进一步研究了CENPO对细胞增殖和转移的作用。IHC染色显示，在LUAD组织中，CENPO显著上调(图12A)。Mann-Whitney U分析显示，CENPO表达与肿瘤分期显著正相关。在75个LUAD组织中，36个组织和4个正常组织中发现CENPO高表达 (图12B)。Pearson相关分析进一步表明，CENPO高表达可预测LUAD患者病情恶化，肿瘤分期越高，CENPO高表达患者比例越高(图12C)。

Celigo染色结果表明，CENPO基因下调可抑制A549和HCI-H1299细胞的增殖。Transwell腔室显微照片显示shCENPO组细胞明显少于shCtrl组(图13A)。与shCtrl组相比，shCENPO组A549和HCI-H1299细胞在48 h和36 h内的迁移能力分别显著下降。每个区域侵袭细胞特异性显示A549和HCI-H1299细胞明显减少(图13B-C)。

通过对小鼠异种移植模型的持续监测发现，shCENPO组小鼠肿瘤体积明显小于shCtrl组(图14A-B)。CENPO基因敲除后，肿瘤的平均重量明显下降(图14C)。当日监测结果显示，shCENPO组的荧光强度显著高于shCtrl组(图14D)。随后，免疫组化和HE染色显示，与shCtrl组相比，shCENPO组表达KI67信号和炎症损伤的肿瘤细胞数量明显减少(图14E)。此外，总结了下游信号通路的研究结果，CENPO表达的降低降低了NCI-H1299细胞中mTOR磷酸化水平，负向调节CDK1、CDK6和PIK3CA(图14F)。因此，作者认为CENPO下调可能通过介导PIK3CA /mTOR信号通路抑制LUAD。

小结

本文主要研究泛癌中CENPO的作用，在分析的过程中，通过不同的数据库进行分析，无论是样本量还是后期的验证都是具有很强的说服力的。涉及到的癌症类型也很多，以及后续在LUAD中进一步的验证做的方法都是很值得我们学习的。在大多数癌症中，CENPO上调和突变，这预示了较差的预后。CENPO敲除抑制LUAD细胞的恶性表型，表现为增殖减慢、G2周期缩短、凋亡增加、迁移减少和肿瘤发生减弱。此外，CENPO敲除降低CDK1/6, PIK3CA，抑制mTOR磷酸化，提示mTOR信号通路可能参与CENPO介导的LUAD发育调控。在湿实验小鼠体内和基因敲除都得到了很好的结果和验证。