扫码联系客服
各位小伙伴大家好啊！今天给大家分享的文章题为《头颈癌的单细胞分析揭示了早期转移过程中潜在的免疫逃逸机制》，于今年3月发表在Nature Communications（IF=17.694）杂志。
作者提到大多数的研究侧重于转移的终末事件和上皮-间充质转化（EMT）的作用，然而头颈鳞状细胞癌（HNSCC）的bulk分析却发现EMT不是HNSCC淋巴转移的先决条件，所以作者重点关注跨肿瘤组织和淋巴结的细胞类型（癌细胞和CD8+ T细胞），解析相关机制，并进一步分析了潜在的治疗靶点。小编认为，科学研究就应该善于发现问题，并大胆开展研究。接下来，我们一起学习一下这篇文章吧。
结果一、原发和淋巴结转移HNSCC的单细胞转录状态
为了描绘原发性肿瘤和淋巴结转移中的“全肿瘤”单细胞景观，作者开发了一种方案来快速处理新鲜切除的组织以进行单细胞RNA测序和建立原代培养物（图1a）。14例局部晚期HPV阴性HNSCC患者原发瘤和颈部淋巴结组织的53459个细胞通过Seurat聚类分为上皮细胞、唾液细胞，成纤维细胞，免疫细胞和内皮细胞（图1b、c）。统计发现原发和转移部位之间的细胞组成存在差异（图1d），原发肿瘤中CAFs和TAMs的比例更高，而转移部位的B细胞、浆细胞和树突状细胞更多，与TCGA的bulk数据得出的细胞组成相似。此外，InferCNA发现上皮细胞中95%出现拷贝数变化，因此该亚群主要是癌细胞（图1e）。
图1
结果二、肿瘤细胞在转移过程中表现出不同程度的上皮-间充质转化
接下来，作者提取了具有拷贝数变异的上皮细胞作为肿瘤细胞进行重聚类，发现原发瘤和淋巴转移的细胞存在重叠（图2a）。作者为了识别来自原发瘤的具有转移到淋巴组织的结前细胞，分析了不同样本的细胞簇，并比较了原发瘤和淋巴转移人群中的EMT基因，发现除HN257外，所有患者的淋巴结肿瘤细胞的EMT评分高于相应的原发瘤（图2b）。
然后作者通过Monocle构建了轨迹以鉴定与淋巴结上皮细胞“最近邻”的原发瘤细胞。根据起源和方向标记轨迹，结合EMT评分和CytoTRACE鉴定出三种模式（图2c、d）：第一种，伪时序显示从原发瘤到淋巴转移的有序，进行性，逐步过渡，并且原发性肿瘤几乎没有进一步进展，伪时序过度的主要途径包括上皮去分化、氧化磷酸化和EMT（图2e）；第二种是淋巴结前细胞的途径继续明显的轨迹，并且原发瘤也显示出持续进化。GeneSwitch算法也鉴定出这两种模式中进一步识别了原发瘤细胞到结前细胞分化的关键基因上AXL，Aurora激酶，TYMS和STAT2（图2f）。第三种模式中肿瘤轨迹是随意的，没有方向性，并且没有证据表明原发肿瘤在进化上处于“更早”的时间点（图2g）。作者因此假设这个细胞亚群是快速发展且具有侵袭性的细胞亚群，差异表达分析发现该亚群132个上调基因参与氧化磷酸化和肿瘤代谢，而45个下调基因参与免疫逃逸（图h），TCGA数据分析也发现相同的特征的样本具有较差预后（图2i）。因此，作者假设原发瘤中的不同亚群显示出更具侵袭性的表型，可能在淋巴结播散发生后进一步进化。
图2
结果三、识别转移前肿瘤细胞的弱点
作者为了识别这个过程中治疗干预的机会，对患者原发瘤和转移性淋巴结中细胞衍生物进行分析。使用Seurat和PAGODA进行后续分析（图3a），发现肿瘤细胞簇是基于患者的，并且原发瘤细胞和转移细胞出现明显的分离，而EMT是分化的主要途径之一（图2b）。作者将HN137、HN159和HN220中的结前细胞确定为与转移细胞聚集在一起的小初级亚群。这些结前细胞的差异分析将AXL（HN137）和AURKB（HN159和HN220）确定为可能的目标（图3c），并用免疫组织化学或免疫荧光染色验证了肿瘤组织中两个基因的表达（图3d）。通过AXL和AURKB的特异性抑制剂BGB324和barasertib处理患者的原发瘤和转移淋巴结培养物，发现经对应药物处理的转移性细胞与未处理细胞相比，都有较低的细胞迁移、侵袭（图3e-g），而且与AXL低细胞相比，BGB324仅在AXL高原发瘤亚群中特异性抑制侵袭（图3h、i）。结果bulk数据验证ALX或AURKB与EMT之间的相关性后，作者认为AXL和AURKB在侵袭中起着重要作用，并可以作为抗转移的靶点。
图3
结果四、原发瘤和淋巴结转移部位中的CD8+ T细胞的进化分析
10168个细胞降维后根据T细胞标记基因鉴定出10个T细胞亚群（图4a、b），大多数幼稚样细胞来源于淋巴结组织，而其余细胞群似乎在原发瘤和淋巴结转移部位中地位相同（图4b）。然后作者将3387个CD8+ T细胞降维聚类后，基于典型标记标记为幼稚、过渡、组织驻留记忆、功能失调前、增殖和晚期功能失调6个亚群（图4c、d）。将CXCL13-high、LAYN 高衰竭/衰老群体作为终点后使用Slingshot确定了两个轨迹（图4e），轨迹1呈现幼稚标记物逐渐丢失、功能失调（和衰老）标记物逐渐增加以及中间的增殖“爆发”，可能反映了肿瘤靶向CD8+细胞克隆的扩大；而组织驻留记忆细胞(TRM)到功能失调细胞的轨迹（轨迹2）则显示，较少的基因被激活，包括组织驻留(ITGAE)、功能失调(CTLA4)和颗粒酶(GZM)基因的表达水平被上调（图4b）。Geneswitches算法鉴定了轨迹1中关键基因表达的改变和对应的TFs（图4g），作者总结到主要节点是早期KLF2丢失、中期NKG7增加和晚期SOX4、DUSP4和RBPJ增加（图g、h）。
图4
结果五、调节基因驱动肿瘤靶向细胞功能障碍/耗竭
SOX4、DUSP4和RBPJ的表达似乎与功能障碍和耗竭的转变一致，作者接下来通过两个独立数据集对此进行验证。重新分析Puram的研究数据显示功能失调的CD8细胞群中SOX4和RBPJ的表达水平更高，而DUSP4表达更普遍（图5a）；皮肤鳞状细胞癌患者在PD1阻断治疗前后获得的T细胞的scRNAseq发现三个基因在耗尽的CD8亚群中均表现出更高的表达（图5b），不过在PD1阻断后亚群中SOX4和DUSP4的表达水平降低（图5c）。然后作者通过RNAi敲低活化PBMC中SOX4和DUSP4的表达，发现SOX4敲低导致衰老的CD57+以及功能失调的PD1+和 CD39+群体减少（图5d），而对HNSCC原发瘤中浸润淋巴细胞（TIL）培养物敲低SOX4后，降低了PD1+和CD8+细胞的丰度，但对CD57+细胞没有影响。此外，SOX4敲低还导致PD1+CD39+CD8+ TIL亚群减少（图5e）。这不但验证了CD8+ T细胞轨迹的功能变化，而且表明SOX4可以作为调节T细胞功能障碍/耗竭标记物表达的潜在调节剂。
图5
结果六、使用单细胞T细胞受体测序在CD8+ T细胞中建立克隆结构
TCR分析获得的克隆标识符可以阐明CDR3序列并提供独特的数据集来推断T细胞的谱系结构。作者对CD8+ T细胞中鉴定的1590个独特的TCR序列进行分析，GLIPH算法显示出患者之间的极小的共享，不过在17.39%的CD8+细胞中观察到克隆扩增，克隆大小范围为每个克隆2到60个细胞（图5f）。此外，七名患者中的六名发现每个肿瘤（原发瘤和淋巴结）的两个不同位点之间的克隆重叠。而且在功能失调的梯度上克隆性逐渐增加，单个幼稚或TRM衍生的克隆随后被启动和激活以产生跨越这些轨迹的多个功能失调的克隆（图5g、h）
结果七、结前细胞和免疫微环境
前面分析确定了原发瘤的结前亚群具有侵袭和迁移的内在特性，但是转移也需要获得免疫逃逸表型，所以作者通过CellChat分析结前细胞是否特定的免疫调节表型，发现结前细胞与T淋巴细胞互作增加（图6a），而且肿瘤细胞分泌的Midkine（MDK）与CD8+ T细胞上的MDK受体的相互作用似乎是复发性免疫抑制途径（图6b）。
使用MDK抑制剂处理癌细胞悬液，与对照组相比，MDK抑制剂处理后非T细胞丰度下降，而CD8+ T细胞百分比则有所增加，而且HN370和HN380中癌细胞（panCK+）和增殖性癌细胞（ki67+）的丰度也降低（图6c），说明MDK信号可以抑制CD8介导抗肿瘤活性。接下来，作者用HN279肿瘤培养物的结前细胞构建人源化小鼠模型来研究了MDK驱动免疫抑制是否会受到抑制免疫检查点阻断（ICB）疗法的治疗，发现抗PD1治疗后，肿瘤略有减小。通过单细胞RNA-seq发现大多数处理后的癌细胞表达MDK（图6d）和许多不受ICB影响的与结前表型相关的基因（SNAI2、AXL、STAT2），不过AURKB和TOP2A（细胞周期基因）的表达显着下调（图6e），表明癌细胞增殖减少。
与未经治疗的小鼠相比，接受pembrolizumab（治疗癌症的药物）治疗的小鼠的CD8+细胞表现出幼稚、功能失调和记忆减少，同时增殖性、细胞毒性/旁观者、组织驻留亚群增加（图6f、g），而表达MDK受体的CD8细胞的分析显示出相反的趋势，功能障碍的增加和增殖（肿瘤靶向）群体的减少（图6h），表明MDK信号通过PD1阻断剂消除重新激活促进免疫抑制。此外，这些变化也与NFKB1激活相关（图6i、j）。最后，作者总结MDK信号通路是结前细胞逃避CD8介导的免疫调节的途径。
图6
小结：
学习完这篇文章，小编为作者清晰的条理和严谨的逻辑而叹服，也发现了很多亮点：
肿瘤转移和免疫逃逸一直是生信研究的热点，如何推陈出新也是大家思考的重点。我想这篇文章应该可以给你一些启发！
