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导读
坏死性凋亡是一种由RIP1和RIP3介导的程序性细胞死亡，其特征是胞浆内容物大量渗漏和细胞器肿胀。越来越多的证据表明，坏死性凋亡在癌症的发病机制中起着不可或缺的作用。坏死性凋亡调节因子的转录变化对乳腺癌、结直肠癌、慢性淋巴细胞白血病和胶质母细胞瘤等癌症的预后有很大影响。本文探讨了肺腺癌(LUAD)坏死性凋亡的免疫和表观遗传突变格局，确定新的分子表型，并开发基于坏死性凋亡的预后评分系统，以更好地了解LUAD的肿瘤免疫微环境(TIME)。
结果解读
在TCGA-LUAD队列中，作者通过R包“DESeq2”鉴定出30个差异表达的坏死性凋亡基因。为了揭示LUAD中坏死性凋亡调节因子的表观基因组特征，作者分析了甲基化水平。结果表明，DNA启动子甲基化与TERT和GATA3转录表达水平呈负相关，而BACH2与其甲基化水平呈正相关。对拷贝数值的研究表明，30个调节子中存在异常变化，其中TERT和OTULIN具有广泛的CNV扩增频率，而CDKN2A在LUAD中显示显著的CNV缺失。在根据cBioPortal进行的泛癌突变分析中，CDKN2A的突变类型最多，缺失最深，其次是TERT、TRIM和ZBP，扩增频率为11%。在561例LUAD患者中，有111例发生了坏死性凋亡相关基因突变，突变频率为19.79%。但突变频率最高的是ALK，其次是CDKN2A，剪接位点仅见于CDKN2A和IDH1。上述结果有力地表明，跨坏死凋亡调控基因的失衡与LUAD的发生有关。
应用基于K-Means的非监督学习方法对29例的坏死性凋亡的调节分子进行分类。主成分分析证实，有三个聚集亚型（A、B、C簇）在表达水平上可能是与坏死性凋亡相关的分子。热图显示了坏死性凋亡调节因子的表达变化。与坏死性凋亡相关的基因在C簇中的表达水平最高，其次是B簇，然后是A簇。然而，患者的年龄在表型之间的分布没有统计学意义。对三种主要坏死性凋亡表型的KM生存分析显示，B群的预后优势相对突出。单因素和多因素Cox比例风险回归模型显示，B组和C组均可预测LUAD患者的总生存期。此外，年龄和分期也是生存的潜在预测因素。
由于肿瘤免疫在肿瘤进展和细胞增殖中起着至关重要的作用，作者首先推测不同亚型的肿瘤免疫微环境可能是不同的。所以作者首先研究了坏死性凋亡表型与免疫调节剂和免疫检查点之间的相关性。坏死性凋亡对肿瘤免疫微环境的影响结果表明，趋化因子（如CCL11、CCR1、CXCL10和PPBP）在B和C簇中的表达水平显著上调。在B和C群中，白细胞介素素、干扰素和一些其他细胞因子的表达也增加，而A簇则下调免疫分子的水平。与A簇和B簇相比，C簇中有7个免疫分子中的表达最高，这些分子都是免疫治疗的潜在靶点包括CD274(PD-L1)、PDCD1(PD-1)、CD247、PDCD1LG2(PD-L2)、CTLA-4、TNFRSF9和TNFRSF4。作者进一步调查了20种免疫细胞的浸润水平。对基因特征的探索表明，免疫细胞在B簇中的浸润率显著高于C簇，而在A簇中免疫细胞的比例比较低，如CD4+幼稚T细胞、滤泡辅助T细胞和M1巨噬细胞。活化的记忆CD4+T细胞在B簇中的丰度最低，而在A、C簇中的丰度较高。用ssGSEA算法计算了抗肿瘤免疫反应事件中免疫周期信号的得分。其中集群B和C中得分较高，但在集群A中表现出特别低的水平。
作者进一步探索了LUAD分子表型的基因组差异，包括突变特征、SNV和转录因子调控网络的活性。研究发现，集群A和集群C的TMB显著较高。为了进一步分析这些簇之间的转录差异，作者调查了LUAD特异性转录因子和与潜在调控因子（与癌症染色质重塑相关）的关系。作者证实了这三个坏死性凋亡亚群的生物学相关性，因为调节子活性与这些亚群密切相关。与癌变染色质重塑相关的调节子活性信息显示坏死性凋亡亚群表型之间具有不同的调控模式，表明表观遗传驱动的转录网络可能是这些簇的重要分化因素。另外作者发现，簇A和C也具有相似的调节模式，而簇A显示出更高的SIRT1、SIRT4和SIRT5活性。同时，SIRT1、CLOCK、EP300、HDAC5、SIRT4、SIRT2、HDAC10和HDAC8的调控子在簇B中显著丰富。
作者除了探索坏死性凋亡三种表型之间基因表达的差异，还分析了几种与癌症相关的信号通路的特点，这有助于理解潜在的潜在调控机制和可用药通路。在泛癌分析中，坏死性凋亡调节分子与细胞周期、细胞周期A、EMT-A和激素AR-A等激活通路相关，但会抑制细胞周期I、激素AR/ER-I和RTK-I等功能。在LUAD中，大多数坏死性凋亡相关基因与激活了细胞周期、EMT和凋亡等通路有关，与抑制激素ER和RTK信号有关。作者还筛选在坏死性凋亡作用的30个调控因子中的中枢基因。结果表明，TNFRSF21的比重最高，其次是Diablo和TRAF2。为了分析这些不同的坏死性凋亡表型的生物学行为，作者进行了GSVA富集分析。如下图所示，簇A显著富集到RNA聚合酶、氨基酰tRNA生物合成、同源重组和DNA复制。在B簇中，Noch、NRF2、RAS和TGFb的得分较高，而在C簇中，细胞周期和TP53信号通路被激活。这提示了坏死性掉啊王在塑造肿瘤免疫微环境和免疫应答方面的重要意义，进一步提示了坏死性凋亡在LUAD化疗和免疫治疗中的潜在应用前景。
然后，作者开发了一种名为NecroScore的评分系统，基于与坏死性凋亡相关的分子来衡量LUAD患者的坏死性凋亡水平。通过比较三种亚型之间的NecroScore水平，通过Welch单因素方差检验发现，NecroScore在C簇中最高，其次是A簇，然后是B簇。根据TCGA和GEO队列中的KM生存分析，NecroScore高的患者比NecroScore低的患者预后更差。高NecroScore组的不吸烟率较高，晚期患者较多，但年龄和性别分布无统计学差异。单变量COX模型显示年龄、病理分期和NecroScore与生存结局显著相关。通过t检验确定低NecroScore患者与高NecroScore患者相比具有显著的治疗优势。在三个独立的预后因素中，肿瘤分期与患者预后最为相关，其次是年龄，然后是NecroScore。此外，作者还发现，低TMB和高NecroScore的患者预后较差，而高TMB和低NecroScore的患者表现出明显的预后优势。
作者分析了坏死性凋亡相关分子与LUAD治疗的临床疗效之间的关系。根据GDSC的药物反应数据，BAHC2、LEF1、DNMT1、TERT、TNFRSF1B、TNFSF10、MPG和ALK等基因与药物具有协同作用，而Panx1、Ax1、SLC39A7、TNFRSF21和ID1与药物具有拮抗作用。鉴于坏死性凋亡的调节分子在化疗中的重要性，作者进一步分析了NecroScore能否准确预测LUAD患者的化疗敏感性。结果表明，NecroScore越高，顺铂、多西紫杉醇和紫杉醇等几种LUAD特异性药物的IC50（半抑制浓度）越低。相反，NecroScore低的患者可能对erlotinib(酪氨酸激酶抑制剂/TKI)、gefitinib (EGFR-TK抑制剂)和lapatinib (TKI)更敏感。
全文总结：
这项研究描绘了LUAD肿瘤微环境中坏死性凋亡的免疫格局。这三种表型可以区分LUAD的临床特征、免疫浸润和体细胞突变特征。作者建立的NecroScore评分系统可在一定程度上预测患者预后和化疗疗效。另外用多组学方法对个体肿瘤坏死性凋亡模式进行综合评估，将加深我们对肿瘤免疫微环境的理解，并制定更有效的免疫治疗策略。
