同学们大家早上好，今天分享的文章是近期发表在《Molecular Therapy-nucleic Acids》（IF：10.18）杂志上，本篇文章总结15种癌症的单细胞数据，从轨迹分析和TF的角度，全面解析T细胞的转变状态，逻辑清晰，让我们一起来学习吧！！

Identification of shared characteristics in tumor-infiltrating T cells across 15 cancers

摘要

肿瘤浸润T细胞在肿瘤免疫治疗中起着至关重要的作用。在T细胞异质性的研究方面取得了很大的进展。然而，关于肿瘤浸润T细胞在癌症中的共同特征知之甚少。在这项研究中，对15种癌症中的349799个T细胞进行了泛癌分析。结果表明，相同的T细胞类型在不同的癌症中有相似的表达模式，由特定的转录因子(TF)调控。多种T细胞类型的转变路径在癌症中是一致的。与CD8⁺ T细胞转化为终末分化效应记忆(Temra)或衰竭(Tex)状态相关的TF调节与患者的临床分类有关。总的来说，本研究揭示了不同癌症中肿瘤浸润T细胞的共同特征，并提出了未来合理的靶向免疫疗法的途径。

1.15种癌症中T细胞亚型

作者收集了15种癌症的单细胞数据，质量控制后，共获得来自101例患者的肿瘤、相邻正常组织和外周血349799个T细胞，其中35.5%-87.5%的细胞有TCR数据(图1A)。为了进一步了解肿瘤浸润性T细胞的特征，分别对CD4⁺和CD8⁺ T细胞进行无监督聚类分，共鉴定出19个CD4⁺和17个CD8⁺ T细胞群(图1B)。这些细胞簇在不同组织中分布不同(图1C)。PBMC以Naive Clusters为主，Trm主要分布在正常组织中。CD4_CX3CR1⁺ Temra主要分布在邻近正常组织和PBMC中，CD8_CX3CR1⁺ Temra主要分布在PBMC中。CD8_CXCL13⁺ Tex和Treg富集。此外，还在CD4⁺和CD8⁺ T细胞中发现了增殖基因高表达的细胞群。细胞周期评分显示，这些簇处于G2M或S期，还高表达耗尽或Treg相关标记基因 (图1D)。

2. 15种癌症中共享T细胞状态转换路径

利用拟时序分析CD4+T细胞的分化轨迹，发现CD4_CCL5⁺ Tm和CD4_CXCR6⁺ Th17是幼稚细胞分化为其他细胞的中心 (图2A)。CD4_CCL5⁺ Tm和CD4_CXCR6⁺ Th17与下游细胞群具有显著的标记基因共享(图2B)。轨迹分析显示，CD4_ISG⁺ Treg、CD4_NMB⁺ Treg和CD4_HSPA1A⁺ Treg在不同的癌症中以过渡状态出现，然后发展为CD4_TNFRSE9+ Treg(图2A)。在CD8⁺ T细胞中，观察到多个耗尽路径，其中在CRC、ESCA、MM、OV、PACA、THCA和UCEC中已经发现了从CD8_Tn到CD8_IL7R⁺ Tm再到CD8_ZNF683⁺ Trm到Tex的路径(图2A)。在所有癌症中观察到，无论对每个癌症进行集体或单独的轨迹推断，从CD8_TXNIP⁺ T到Temra或Tex，其中CD8_KLRG1⁺ T和CD8_GZMK⁺ T位于两者之间(图2A)。此外，发现CD8_TXNIP⁺ T与CD8_ZNF683⁺ Trm的标记基因有显著的同源性，包括ZNF683、CXCR6、ITGAE和KLRC1(图2C)。STARTRAC-migr分析显示，PBMC和肿瘤之间CD8_TXNIP⁺ T细胞具有高度的TCR共享 (图2D)。CD8_TXNIP⁺ T细胞与Trm和CD8_RPL36A⁺ T细胞高度相关(图2E)。富集分析显示CD8_TXNIP⁺ T细胞参与免疫细胞活化和增殖，包括T细胞活化、淋巴细胞分化和T细胞增殖调控(图2F)。

3.癌症中临床状态相关的TF调节

TF一直被认为在维持细胞特性方面起着核心作用，作者利用SCENIC分析scRNA-seq中基因调控情况，解析每种癌症中细胞状态改变。对于肿瘤浸润的T细胞，不同癌型调控调控存在特异性，表明T细胞在特定的环境中经历了特定的转录调控。作者筛选出了每一种细胞类型中至少存在于5种癌症中的调节因子，并分别在CD4+和CD8+ T细胞群中获得了67和58个调节因子。这些调控在CD4⁺和CD8⁺ T细胞之间显著共享(图3A)。这些规律与相应细胞类型的功能有关。TBX21在CD4⁺和CD8⁺ T细胞中均被鉴定为Temra特异性调控因子(图3B)。同时，作者还计算了特定调控因子的调节活性评分(RAS)与每个簇中TCR克隆性之间的相关性(图3B)。在不同的癌症中，这些调控因子的活性与TCR的克隆性相关。例如，在5种癌症中，TBX21与TCR克隆性呈正相关。

基于上述分析，作者分析了CD8_TXNIP⁺ T、Temra和Tex在肿瘤组织中的差异调控。最后，与CD8_TXNIP⁺ T相比，在5个或更多的癌症中，发现了14个在Temra中上调而在Tex (Temra-activated TFs)中下调或在Temra中下调而在Tex (Tex-activated TFs)中上调的调控蛋白，作者称之为状态转换TFs(图3C)。状态转化TFs在肿瘤组织和其他组织中的表达差异显著(图3D)。作者利用TCGA肿瘤数据进一步研究了状态转换TFs的表达与患者生存的关系，发现它们显著影响了不同癌症患者的总生存期。根据状态转换TFs在TCGA中的表达进行了癌症分型。划分的亚型和生存显著相关，发现在KIRC中C2亚型，Temra-activated TFs表达水平高，预后较好(图3E和3F)。两组间性别、年龄差异无统计学意义，但C2组大部分标本病理分期为低分期(图3G)。

作者利用从TIGER数据库下载的癌症免疫治疗数据，探讨免疫检查点阻断治疗后这些TF的变化。结果显示，IRF4除外，治疗后黑素瘤状态转化TFs的表达显著上调（图3H）。此外，在另一个黑素瘤免疫治疗数据集中，除ETV1和EZH2在无应答者中高表达外，状态转移TFs在有应答者中高表达(图3I)。总之，发现的T细胞状态转移TF调节有助于肿瘤的分类，并可作为独立的预后因素和免疫治疗靶点。

4. 癌症中普遍激活的T细胞相互作用途径

细胞与细胞之间的相互作用涉及多种信号通路，将从每个癌症的不同组织推断出的信号通路映射到一个二维的流形上，并聚集成不同的组。BCL、OV、PACA有肿瘤特异性组，PACA、OV有正常特异性组。在其他癌症中也观察到以不同组织为主的群体。通过计算不同组织中任意一对共享信号通路之间的欧氏距离，发现CCL、CXCL和FASLG通路的距离较大，而IFN-II通路的距离较小(图4A)。此外，根据各信号通路的信息流，发现肿瘤中某些通路的变化是不同的，包括TNF、PARs、CLEC、ITGB2和IL-16。配体受体(LR)对这些通路的贡献在所有癌症中都是一致的(图4B)，这些LR基因在肿瘤浸润T细胞中表达上调。发现GALECTIN是除OV外所有癌症中CD8_TXNIP⁺ T细胞的进入信号通路(图4C)。GALECTIN的外出细胞主要来自STMN1⁺和ISG⁺ T细胞簇(图4D)。GALECTIN通路的贡献LR对为LGALS9-HAVCR2/CD45/CD44(图4B)。LGALS9在ISG+和STMN+ T细胞中特异性表达，尤其是在ISG+ T细胞中(图4E)。对GALECTIN、ISG⁺ T细胞簇特异性调控蛋白LR对的蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络分析，以及先前发现的CD8_TXNIP⁺ T、CD8_Temra和CD8_Tex之间的差异调控蛋白，发现它们相互作用(图4F)。

发现LT通路的输出信号仅在Treg中存在(图5A)。其配体LTA是Treg特异性调控REL和NFKB2的靶基因，其配对受体的下游TFs为TNF信号通路相关基因(图5B)。同时，发现肿瘤组织中TNF信号通路相关基因同时上调(图5C)。TNF信号通路的活性在每种T细胞类型中是不同的(图5D)。这些结果表明，Treg通过LTA-TNFRSF1B激活受体细胞中的TNF信号通路，进而影响其他细胞的命运(图5E)。

5. 泛癌中T细胞的TCR图谱

TCR是介导T细胞免疫的关键因子，分析TCR有助于了解T细胞免疫。作者分析了CD4⁺和CD8⁺ T细胞的基线库。肿瘤组织中T细胞的TCR多样性和克隆性明显高于正常组织和PBMC(图6A)。GLPH2 TCR聚类得到CD4⁺和CD8⁺ T细胞26922和14565组，其中22.1%和47.6%具有肿瘤类型特异性。具有相同V、J和CDR3序列的T细胞被定义为相同的克隆型，相比较于CD4⁺T，CD8 ⁺ T细胞的TCRs克隆百分率显著升高（图6B）。CD8⁺ T细胞中TCR的克隆率为BCL的7.6% ~ RC的20.1%，CD4⁺ T细胞中TCR的克隆率为NPC的0.5% ~ RC的7.1%。单个克隆型的克隆大小与肿瘤中克隆TCR的总数量成正比(图6C)。

通过分析T细胞群的TCR特征，发现幼稚型T细胞的克隆扩增很少，高度扩增的TCR主要分布在Temra和Tex细胞中(图6D)。还比较了CD8_CX3CR1⁺ Temra和CD8_CXCL13⁺ Tex在肿瘤中的扩展情况，发现CD8_CX3CR1⁺ Temra在BRCA、MM、THCA和RC中高度扩展，而CD8_CXCL13⁺ Tex在UCEC、PACA、ESCA和ESCC中高度扩展(图6E)。由于轨迹分析显示CD8_TXNIP⁺ T细胞向Temra或Tex转移，作者研究了这些簇间TCR特征的变化，TCR的克隆性沿着发育轨迹逐渐增加(图6F)。发现两种发育路径中CDR3区域的氨基酸类型存在差异(图6G)。例如，在Tex路径上，CDR3b中极性氨基酸的比例显著增加，而在Temra路径上，非极性氨基酸的比例显著增加。

小结

本研究对来自15个癌症数据集的T细胞进行了系统分析，在不同的组织中鉴定了不同功能状态下的T细胞类型。特别是在在CD4⁺ T细胞中观察到多个Treg亚群，CD4_TNFRSF9⁺ Treg代表激活状态。Treg可抑制针对自身抗原的异常免疫反应，也可抑制抗肿瘤免疫反应轨迹分析揭示了这些Treg簇在癌症中向激活状态的转变。CD4_TNFRSF9 Treg和CD4_ISG⁺ Treg在泛癌中发生了向激活状态的转变。本文整合了多种癌症数据集，对癌症中T细胞进行更细致的刻画，在分析思路上值得我们学习，也在癌症的治疗上提供了性的方向。