胰腺癌是最具破坏性的癌症之一,胰腺癌的进展是由多个激活通路和表观遗传水平上的串扰事件引起的。RNA修饰作为一种可逆的表观遗传机制,在包括肿瘤发生在内的几乎所有重要生物过程中发挥着关键作用。今天小编就带大家阅读一篇2022年12月19日,发表在Frontiers in Immunology(IF:8.786)的文章,看看作者是如何从RNA修饰出发进行探索的吧!
Interplay of four types of RNA modification writers revealed distinct tumor microenvironment and biological characteristics in pancreatic cancer
四种类型的RNA修饰writers的相互作用揭示了胰腺癌中不同的肿瘤微环境和生物学特征
文章概述
胰腺癌(PC)是最致命的恶性肿瘤之一。四种类型的RNA修饰(即M6A、M1A、APA和A-to-I)可以被不同的酶化合物(“writers”)催化,介导许多癌变和免疫调节的表观遗传事件。 作者首先在TCGA中获得26个RNA修饰writers的特异表达模式和转录变异。进行无监督共识聚类,将患者分为两个RNA修饰聚类(WM_score_high和_low)。在此基础上,建立了基于差异表达基因的RNA修饰评分模型,并在ICGC数据集上进行了验证。WM_score_high亚组与较差的预后、Th2/Th17细胞极化和致癌通路(如EMT、TGF-B和mTORC1信号通路)相关,而WM_score_low亚组与良好的生存率和Th1细胞趋势相关。WM_Score模型在解释转录和转录后事件方面也证明了稳健的预测能力。WM_score模型在表观遗传学、免疫学和生物学方面具有较强的预测能力,为今后临床判断PC提供了理论依据。
主要结果
PC中四种RNA修饰writers的转录变异
作者从目前已发表文献中筛选了26个RNA修饰writers(7个m6A writers、4个m1A writers、12个APA writers和3个A-I writers)。 为了探索PC中四种类型的RNA修饰writers的潜在转录变异,统计了26个writers中非同义体细胞突变的频率。 如图1A所示,821个样本中71个存在RNA修饰writers的突变。其中,PCF11突变频率最高,CPSF1、ADARB2、WTAP和RBM15次之。尽管这些writers的不同突变状态之间的总体生存率之间的比较不显着,但具有突变的PC患者的生存率低于无突变的患者,这意味着转录改变可能在PC的进展中起着至关重要的作用。作者还评估了这些writers的体细胞CNV。有趣的是,ADAR、CPSF1、TRMT61B、CPSF4和CSTF1具有广泛的CNV扩增,而WTAP、ADARB1、RBM15、RBM15B和CF1具有较少的CNV扩增(图1B)。为了进一步了解这26个RNA修饰writers的表达与转录变异状态之间的关系,作者比较了这些writers在配对的正常组织和PC组织中的mRNA表达,大多数writers在PC组织中高表达(图1C- F)。那些具有CNV扩增的writers在PC组织中显着高表达,反之亦然。这表明CNV可能是这些writers转录过程中的一个关键因素。尽管如此,一些writers表达广泛,但CNV缺失。因此,为了检查PC中CNV和mRNA表达之间的差异,作者集中研究了不同writers中CNV状态的亚组,这些writers在超过20%的样本中拥有CNV缺失。在CPSF2、ADAR 和 TRMT61A 中,CNV扩增的PC患者的mRNA表达高于CNV缺失的患者。所有这些分析确定了26个RNA 修饰writers的转录场景和mRNA表达之间的联系。
TIME和癌症标志与RNA修饰writers的模式相关
为了探究这些RNA修饰writers之间的相互关系,计算了它们之间的Pearson相关系数,发现除了TRMT61A之外,大多数相关性都是正相关的。此外,单因素Cox分析显示26个writers中10个writers是PC患者的独立预后因素。因此,这些检测使作者确认某些串扰关系可能存在于特定的RNA修饰簇中。然后,根据上述筛选标准,进行无监督共识聚类,根据22个选定的RNA修饰writers的表达矩阵,将PC患者分为Writer_cluster_1和Writer_cluster_2(图2A-E)。值得注意的是,Writer_cluster_1的特点是APA writers(CPSF1, CPSF4, PABPN1)的高表达,而m6A writers(METLL14, ZC3H13, VIRMA)的过度表达总是发生在Writer_cluster_2;此外,METTL3在Writer_cluster_1中被上调,证实了PC的独特m6A调节模式(图2E)。然后,GSVA分析被用于研究两个不同的RNA修饰簇的分子和生物学功能。Writer_cluster_1在DNA修复、碱基切除修复和RNA聚合中明显富集,而Writer_cluster_2在肿瘤发生和免疫反应时期明显富集,如EMT、JAK/STAT信号通路和趋化因子信号通路(图2F)。分别以OS、DFI、PFI和DSS作为事件的终点,发现,RNA修饰的Writer_cluster_2模式表现出比Writer_cluster_1模式更优的生存率(图2G-J)。在研究中仍然考虑了不同RNA修饰模式的时间。CIBERSORT算法被用来衡量两种不同的RNA修饰模式之间的组成差异。在大体上,26种RNA修饰writers的表达情况与肿瘤免疫浸润高度相关。两种模式中22种免疫细胞的丰度也被量化(图2K)。RNA修饰的Writer_clsuter_1模式拥有较高的免疫抑制细胞(如T细胞调节)的浸润,这与图2G-J中的不良预后相一致。
构建和验证RNA修饰writers的signature
为了进一步研究两种不同的RNA修饰模式的生物学机制,作者进行了差异分析,确定了215个与不同RNA修饰状态相关的DEGs。并进行富集分析,为了验证调控的异质性,根据这些DEGs应用无监督共识聚类,将PC患者分为DEG_cluster_A和DEG_cluster_B。与RNA修饰writers的聚类一致,大多数聚类在Writer_cluster_1的患者对应于DEG_cluster_A,而Writer_cluster_2对应于DEG_cluster_B。TCGA队列中的患者按7:3的比例被随机分配到训练和测试组。根据DEGs,进行单变量Cox回归以减少冗余,剩下38个预后相关的DEGs。接下来,使用LASSO-Cox算法来区分TCGA训练集中的两种RNA修饰模式(图3A)。最后,建立了一个基于10个DEGs的模型,名为WM_Score模型,并根据WM_Score的中位数将PC患者分为WM_Score_高(WM_high)和WM_Score_低(WM_low)组。通过ROC曲线评估WM_Score模型对总生存期的预测能力,在TCGA训练集中AUC达到0.722,2年为0.743,3年为0.756,并在TCGA测试集中得到有力验证(图3B,C)。巧合的是,这三个分型(Writer_cluster_1/2、DEG_cluster_A/B和WM_Score_high/low)通过不同的计算策略表现出高度的一致性(图3D)。WM_cluster_2比WM_cluster_1有更高的WM_Score。同样的道理,DEG_cluster_B的WM_core比DEG_cluster_A高(图3E,F)。随后,比较了WM_Score_高组和WM_Score_低组的预后和临床病理特征。与WM_Score_高组的患者相比,WM_Score_低组的患者表现出较好的生存率(图3G-J)。多变量Cox分析显示,WM_Score与预后有明显的对应关系,而年龄、性别、分期、分级和肿瘤大小不相关(图3K)。为了进一步验证WM_Score模型的可靠性和实用性,使用ICGC和GEO数据集进行外部验证(图3L,M)。
WM_Score模型与分子生物学特征的交互作用
为了探索上述不同的WM_Score亚组的功能作用,进行GSVA分析。发现WM_Score_高组在EMT、TGF-b和mTORC1信号通路上富集(图4A)。为了研究与EMT通路的相关性,根据上皮和间质标记基因的表达计算了EMT评分。间质化趋势越强,WM_Score越高,这可能解释了WM_Score_高组的生存率较差(图4B)。从已发表的数据来看,PC可以分为三种转录组分类的分子亚型(MS),包括Moffitt分类、Collisson分类和Bailey分类。根据文献中这三种MS分类的标志性基因特征,进行了无监督的共识聚类,将PC患者分为不同的MS。为了评估MS和WM_Score之间的关系,分析了TCGA数据集中MS的WM_Score。在所有9种MS中,基底样、QM-PDA和鳞状亚型的WM_Score相对较高,这可能与它们的不利预后有关(图4C-E)。作者还对这三种分类进行了重叠分析,通过直方图的分布进行了可视化。一致的是,恶性MS程度高的患者(如基底样和鳞状亚型)倾向于被确定为WM_Score_高组,反之亦然(图4F-H)。此外,晚期PC的WM_Score高于早期等级和阶段的PC(图4I,J),意味着这种WM_Score模型可能对临床前诊断更敏感。然而,WM_Score在年龄、性别和肿瘤大小之间没有明显差异。
与WM_Score相关的转录和转录后调控
RNA修饰历来被认为是转录和转录后的调节因子,而WM_Score模型则是基于RNA修饰writers进行的。因此,集中研究了与WM_Score有关的转录和转录后事件(如APA、m6A和m1A)。APA通过为mRNA提供3'UTR促进转录的改变,而3'UTR是miRNAs的结合位点,作者提出两种RNA修饰状态可能有特定的miRNA特征,基于对不同writers的调控。首先,对WM_Score_hingh组和_low组进行了差异化分析,42个miRNA被筛选出来,并对其靶基因进行了富集分析,确定了8个miRNAs、14个mRNAs和9个富集的通路(图5A)。作者确定了两个RNA修饰之间的基因具有不同的PDUI,并发现大多数具有负PDUI(缩短3'UTR)的基因富集在WM_Score_high组(图5B)。通过单变量Cox分析,选择了5个预后相关的基因进行验证。在WM_Score_high组中,COL1A2的3'UTR明显延长,而DKK1、AREG和CEACAM5的3'UTR则明显缩短。对于那些3'UTR延长的基因,延长组的病人比缩短组的病人生存率更差,同样的现象也出现在3'UTR缩短的基因上(图5C-F)。为了研究WM_Score是否与m6A和m1A有关,通过RMVar数据库探讨了DEGs与m6A或m1A之间的相应关系。WM_Score是一个基于RNA修饰writers的综合预测模型(图5G,H)。
识别针对WM_Score模型的潜在化合物
为了确认WM_Score对药物敏感性的影响,进行Spearman相关分析,以计算WM_Score和基于GDSC数据集的药物反应之间的关系指数。我们发现38个潜在的化合物与WM_Score有明显的关系。探索这些化合物的靶向通路。结果显示,针对WM_Score_低患者的化合物可能调节MAPK、DNA复制和基因组的完整性,以加强其自身的敏感性(图5I)。综上所述,WM_Score被证明是一种创新的PC治疗目标。
WM_Score预测了独特的TIME和免疫基因组学模式
为了研究WM_Score模型的不同TIME,根据TCGA数据集中患者的表达谱,应用了CIBERSORT和ESTIMATE算法。根据WM_Score_high组和WM_Score_low组的22种免疫细胞的丰度没有明显差异,但WM_score与ESTIMATEScore、ImmnueScore和StromaScore呈正相关,意味着WM_Score模型中免疫细胞的浸润高度丰富。为了进一步验证不同WM_Score亚组之间的免疫细胞浸润,根据基因签名 "LM22 "对28种基质和免疫细胞类型进行了ssGSEA,在两个不同的WM_Score亚组中发现了多种T细胞浸润(图6A)。考虑到PC是一种免疫冷肿瘤,基于WM_Score对PC的免疫基因组模式的探索是迫切需要强调的。四种类型的T细胞(Th1细胞,Th2细胞,Th17细胞和Treg细胞)参与以下分层分析。从MSigDB数据库中提取BIOCARTA_IL12_PATHAY和BIOCARTA_IL4_PATHWAY作为背景基因集,分别计算基于这两个基因集的ssGSEA评分。然后,将这两个ssGSEA分数相减的中值确定为区分患者与 Th1_trend 和 Th2_trend 的分界点。如图6B所示,Th2_trend患者的WM_Score 高于Th1_trend患者。另一方面,从PathCards数据库中下载Th17细胞分化基因集,并根据通过该基因集计算的ssGSEA分数的中值将患者分为Th17_diff_up和 Th17_diff_down 组,发现Th17_diff_up组中的患者倾向于获得更高的 WM_Score(图 6C)。为了进一步证实 WM_Score 中T细胞浸润的机制,从已发表的文献中筛选了这四种类型 T 细胞的几种细胞因子标志物,并比较了它们在不同 WM_Score 亚组之间的表达模式。从整体来看,WM_Score_high 组聚集了更丰富的这些 T 细胞浸润(图6D-G)。
总结
文章到这里就要结束了,是不是意犹未尽呢!文章从RNA修饰出发,利用多组学数据进行挖掘,逻辑清晰,层层递进,是一篇非常值得借鉴的文章。纯生信发文越来越难,但是,只要找好角度,设计好思路一样可以发文章,看完这篇文章的你,心动了吗?