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大家好呀，今天小编给大家带来本月刚刚发表在Cancer Discovery上的一篇单细胞的文章——Natural coevolution of tumor and immunoenvironment in glioblastoma（IF:38.272）作者一共整合了306,324个多灶性GBM单细胞，包括转录组、表观基因组和蛋白质组数据，来研究原发性GBMs自然进化过程中肿瘤细胞与微环境之间的关系。
4例多灶性GBMs的患者(即NJ01、NJ02、TT01和TT02)(每个病例有2个原发性IDH野生型病变)，对这些样本进行单细胞RNA测序(NJ01: 21,518个细胞;NJ02: 21715;TT01: 10767个细胞;TT02: 7062细胞)，如下图所示。
IDH野生型胶质母细胞瘤(GBM)是成年人最常见和最具侵袭性的脑瘤类型。由于肿瘤恶性程度的演变，改善GBM的预后仍然具有挑战性。标准护理，去肿瘤手术后放疗联合替莫唑胺，中位生存期约15个月。大多数患者在初次治疗后十个月内复发。由于GBM中存在显著的免疫抑制的微环境， ICIs并没有给GBM患者带来实质性的临床益处。肿瘤细胞与免疫细胞之间的通讯在肿瘤进展中起着至关重要的作用。因此，系统地表征GBM的自然发展过程，揭示疾病发展过程中免疫微环境重构的潜在机制至关重要。
由于缺乏合适的模型和技术，目前尚不清楚肿瘤细胞在自然疾病发展过程中如何与肿瘤微环境相互作用。多灶性GBMs被认为是研究GBM自然进化的极好模型，因为它们可能代表了肿瘤发展的不同阶段。越来越多的证据表明，大多数多灶性GBMs在早期由共同的肿瘤前体细胞克隆而来，并经历长期的平行遗传进化。本文通过对多灶IDH野生型原发性GBMs应用scRNA-seq来研究肿瘤进展，从而对肿瘤自然进化过程进行的高分辨率描述。
基于单细胞mRNA表达谱推断拷贝数变异结果显示，四个病例中的两个病变均来自同一祖先（图2）。且NJ01和NJ02之间存在时间顺序，其中一个病灶处存在拷贝数变化在其他病灶中未发现。这表明一个病灶可能是另一个病灶的种子。
RNA速度分析发现4个肿瘤都有从第2个病灶向第1个病灶转移的潜在趋势(图3C)。第2个病灶的肿瘤细胞可能是新的“bamboo shoots”，最终可能发展为第1个病灶的肿瘤细胞表型。第1个病灶可能比第2个病灶older。
根据非肿瘤细胞的组成成分，超过45%的非肿瘤细胞是髓样细胞(主要是巨噬细胞)，这与之前的发现一致，髓样细胞是GBM中主要的非肿瘤细胞群。在GBM中，肿瘤相关的巨噬细胞可能来源于外周骨髓衍生的巨噬细胞(BMDM)或驻留的小胶质细胞(MG)。在四个病例中识别了BMDM和MG细胞。第1个病灶的BMDMs与MG的比值高于第2个病灶(图3F)。
在第一个结果中作者已经确定了两种病灶之间的时间顺序，接着作者研究了何种转录特征可以表征这种进化。差异表达分析发现第1个病灶中表达的DEGs比例明显高于第2个病灶(图4A)，表明GBM的自然进化可能伴随着广泛的基因激活。通过四个样本中DEGs的重叠，保留了28个基因。这些基因被进一步筛选在GBM中表达的基因，并进行蛋白-蛋白相互作用，得到一个由CD44、FOSL2和ANXA1等12个基因组成的模块。将该模块中的基因标记为自然进化特征(NES)，并假设更高的NES反映了更长的进化史。如图4B所示，older病灶中表达NES基因的肿瘤细胞比例高于younger的病灶。ssGSEA构建基于NES基因的评分算法。轨迹分析显示，高NES可能是GBM的进化终点(图4C)。作者分别使用患者衍生外植体(PDEs)的数据集和小鼠模型，结果符合预期（图4D,E）。
作者根据细胞状态特征分数将细胞映射到一个六边形图中，NES显示出从PN亚型到MES亚型的逐步增加和过渡方向(图4G)。作者接着探讨了NES与临床结果之间的关系，分别使用TCGA和CGGA的GBM数据进行了多因素cox分析，km曲线表明低NES(lNES)预后比高NES(hNES)组好(图4H)。
之后作者研究了NES转化过程中的转录调控。在TCGA IDH野生型GBMs中发现了四个TF的调控活性评分与hNES显著正相关以及一些在NES较低样本中激活的TF(图5A)。在这些转录因子中，E2F1和MYBL2都参与调控细胞增殖和生长。这些TF在大脑发育过程中也表现出明显的表达模式(图5B)，其中与hNES相关的TF更可能在发育后期表达。
那么促进NES状态转变的潜在因素是什么？作者测试了NES与一系列微环境相关通路的相关性(图5C)，其中缺氧反应与NES显著相关。通过比较不同氧水平(即5%和20%)培养下胶质瘤细胞的NES变化，发现缺氧条件下肿瘤细胞的NES更高(图5D)。低氧条件下敲除肿瘤细胞的低氧诱导因子(如HIF1A)，NES显著降低，且siHIF1A处理的肿瘤细胞显著降低了FOSL2 mRNA水平(图5E，F)，说明低氧在加速NES过渡中发挥了重要作用。基于ChIP-Atlas和ENCODE 的ChIP-seq分析显示，在各种癌症类型的FOSL2启动子上游区域(chr2:28618500-28618900)有一个HIF1A峰值(图5G)。综上所述，这些结果表明，缺氧可能通过HI1FA-FOSL2轴潜在地参与NES过渡。
将NES与TCGA IDH野生型GBMs中的BMDM和MG特征相关联。发现BMDM特征与NES呈正相关，而MG特征与NES无相关性(图6A)。两份GBM活检(NJ03和NJ04)的CyTOF分析也显示，hNES-like的GBM 有更高的BMDMs(图6B)。
之后，作者分析了MRI定位活检中GBM mRNA的表达谱。BMDM和NES在对比强化区域均表现出较高的富集分数，在另一套数据集中发现hNES样本在PC区域显著富集(图6C,D)，提示BMDM和hNES肿瘤细胞容易在肿瘤组织的核心区域富集。综上，这些发现提示BMDMs浸润可能与hNES肿瘤细胞有关。
作者将髓样细胞重新聚类并识别了17个子簇。计算每个子聚类的M2-like和 BMDM-like signature分数。发现mac_PLIN2、mac_IL32和mac_FCN1显示了大量BMDM-like和M2-like特征的细胞。此外，基于TCGA IDH野生型GBMs的mRNA谱分析了这些BMDM相关子簇的分子标记与NES之间的联系。发现83%的signature与TCGA IDH野生型GBMs的NES评分呈正相关。
CellphoneDB发现“肿瘤细胞-髓细胞-T细胞”通讯轴是细胞通讯网络的重要组成部分(图6F)。髓系细胞(主要是巨噬细胞)可能是肿瘤细胞和T细胞之间的中介细胞，这表明髓系细胞在促进免疫微环境重构和肿瘤进展中具有重要作用。为了揭示BMDMs和hNES肿瘤细胞之间潜在的相互作用轴，CellphoneDB发现older病灶比younger病灶表现出更多的配体受体相互作用(图6G)。在肿瘤簇中，ANXA1作为配体与BMDMs上的FPR1/3受体相互作用，主要在第1个病灶中(图6G, H)。最后，通过探索TCGA IDH野生型GBMs的mRNA表达，发现ANXA1的表达与BMDM signature显著相关(图6I)，但与MG特征值无关，提示ANXA1可能与BMDMs浸润有关。
接下来，作者使用ChIP-Atlas寻找潜在的ANXA1调控因子。作为NES特征之一的转录因子FOSL2在三个神经祖细胞上的ANXA1启动子上游区域出现了一个尖峰(图7A)。TCGA IDH野生型GBMs中，ANXA1表达与FOSL2表达呈正相关(图7B)。
为了确认来自肿瘤细胞的ANXA1对单核细胞的影响，作者基于单核细胞和U251MG GBM细胞系进行了Transwell迁移试验。在这些试验中，肿瘤细胞被敲除ANXA1 (siANXA1)或不敲除(siNC)。在对照组中，单核细胞更容易向肿瘤细胞迁移(图7C)。72h后，与siANXA1组相比，对照组单核细胞表现出M2样巨噬细胞的特征(图7D)，也就是说ANXA1诱导单核细胞分化至免疫抑制状态。CD8+ T细胞与Transwell试验衍生的巨噬细胞共培养的活性状态对照组的IFN γ水平和T细胞增殖率显著低于其他各组(siANXA1组)(图7E)。在T细胞与巨噬细胞共培养时，仅用对照组Transwell实验即可观察到类似的结果(图7E)。这些发现在IVY GAP的mRNA表达中也得到了证实(图7F)。
由于ANXA1可以深刻重塑肿瘤组织的免疫环境，那么，它是否可以帮助肿瘤细胞利用生存优势。通过比较颅内注射有ANXA1敲低的GL261小鼠GBM细胞系的小鼠与对照组(图7G, H)，对照组小鼠的肿瘤尺寸明显大于另一组。shanx1组小鼠的中位生存时间明显更长(图7K)。这说明ANXA1在抑制免疫活性和促进肿瘤进展方面发挥重要作用，可能是GBM治疗的潜在靶点。
BMDM侵袭加速肿瘤NES转移和迁移
通过分析GLASS的原发性和复发性GBMs的mRNA图谱，发现复发性和匹配的原发性GBMs之间BMDM归一化特征评分的差异与手术间隔时间的增加显著相关(图8A)。提示BMDM浸润与肿瘤进展相关。对肿瘤细胞与M2样巨噬细胞共培养24、48和72小时进行RNA测序。共培养肿瘤细胞的NES评分高于单一培养条件下的NES评分(图8B)，表明BMDM细胞有助于加速NES转化。此外，集富集分析发现，上皮-间充质转化(EMT)通路与NES显著相关，且在共培养条件下高度上调，且随培养时间的延长呈逐步升高趋势(图8C)。有报道称FOSL2是促进EMT的重要转录因子。FOSL2 mRNA在与巨噬细胞共培养的肿瘤细胞中表达量较高(图8D)。此外，EMT的富集也提示这些肿瘤细胞在共培养后可能具有侵袭能力。共培养条件下肿瘤细胞中涉及转移的基因富集程度较高(图8E)。此外，基于GSE126725数据的分析显示，与对照组相比，具有高迁移能力的弥漫性胶质瘤细胞具有更高的NES评分(图8F)。
作者进一步研究了BMDMs是否与GBMs相互作用并促进肿瘤迁移。基于TCGA IDH野生型数据集的分析显示，转移样信号与BMDM和单核细胞信号评分显著相关(图8G)。为了进一步确定哪些细胞因子与NES转移过程中的迁移能力相关，作者对TCGA IDH野生型GBMs中的细胞因子和NES进行了相关分析。CCL2 和CCL20与NES评分高度相关(图8H)。当比较四对多灶性GBMs中表达这两种基因的巨噬细胞的百分比时，发现CCL2易于在巨噬细胞中广泛表达(图8I)。在另一套数据中肿瘤浸润巨噬细胞中CCL2 mRNA水平高于外周血周单核细胞(图6K)，说明CCL2的上调只是浸润肿瘤的巨噬细胞的表型。在shCCL2或shNC(对照)条件下进行了48小时的Transwell迁移试验(图6L)，证实了CCL2可以促进肿瘤细胞迁移。此外，通过分析TCGA IDH野生型GBM样本，我们发现与其他患者相比，CCL2级别高的患者预后较差。
该研究整合了多灶性GBMs的单细胞RNA测序，确定FOSL2是older病灶中高表达的特征之一，表明它可能参与了肿瘤的进化。此外，缺氧可能通过激活HIF1A-FOSL2轴潜在地促进NES过渡。FOSL2调节ANXA1，随后可能募集并诱导单核细胞极化为m2样巨噬细胞(图9)。这些极化的BMDMs显示出免疫抑制表型，显著减少CD8+ T细胞的增殖和IFNγ的产生，对GBM的免疫治疗提出了挑战。而ANXA1可能是GBM治疗的潜在靶点。
作者的研究结果还表明，肿瘤细胞与极化巨噬细胞共培养倾向于增加NES，这可能与多种转录因子(如FOSL2)和通路(如EMT)的激活有关。这种进展还伴随着迁移能力的增强，这与极化巨噬细胞产生的CCL2有关(图9)。
