生物有自己的作息规律，例如人们日出而作日落而息，而老鼠等则昼伏夜出，这些节律的本质及运作模式还未被全面研究，在2017年关于昼夜节律分子机制的研究就获得了诺贝尔生理医学奖。而昼夜节律与癌症的关联也越来越受到关注，小编今天就给大家分享一篇2022年8月发表在JOURNAL OF PINEAL RESEARCH (IF:13.007)杂志上使用公共数据研究节律紊乱与肺腺癌免疫微环境及预后关联的单细胞分析文章。

Single‐cell transcriptomic analysis reveals circadian rhythm disruption associated with poor prognosis and drug‐resistance in lung adenocarcinoma

单细胞转录组分析揭示肺腺癌中昼夜节律紊乱与不良预后和耐药有关

一．文章背景

昼夜节律是一种生物内部计时系统，也被认为是一种分子进化机制，其会通过既定的生物钟调控能量代谢和自身维持等多种生理过程。如今越来越多的证据表明，昼夜节律的紊乱(Circadian rhythm disruption, CRD)在肿瘤发生中起着关键作用，并会促进癌症的进展。因此这篇文章使用单细胞数据研究了肺腺癌中CRD与预后和耐药的关联。

二．文章摘要

研究开发了一个算法，并使用该算法对三个肺腺癌单细胞RNA - seq数据集中的昼夜节律紊乱状态进行了评估。研究发现高CRD评分的恶性细胞具有糖酵解和上皮-间充质转化通路激活的特征。此外，细胞通讯分析也表明CRD在T细胞耗竭中起重要作用，这可能是导致恶性肿瘤预后不良的原因，研究也使用组织转录组数据在22种癌症中验证了这些发现。此外，Cox回归分析表明CRD评分是有价值的预后生物标志物。研究也建立了一个包含23个昼夜节律基因的模型，该模型在14个独立队列都表现出良好的免疫应答预测效能。同时，研究也观察到细胞经褪黑素处理后CRD评分会降低。

三．文章的主要内容及结果

1. 恶性细胞的CRD与肺腺癌患者的进展相关

在文章的第一部分，作者研究了恶性细胞CRD与肺腺癌患者进展的关联。

研究从公共数据库获取30个肿瘤样本（27个为原发或远处转移；3个接受了新辅助化疗）。研究首先确定了12个样本的临床已知致癌驱动基因(EGFR)突变情况，这些突变跨越了肿瘤进展的不同阶段(图1A)，经过质控后保留了96 024个细胞，并将这些细胞聚成23个细胞群，并根据标记基因将其注释为单核细胞、NK细胞、肥大细胞、B细胞、T细胞、成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞(图1B)。

基于评估的拷贝数变异分离出恶性细胞，且观察到恶性细胞的数量随着癌症分期的进展而增加(图1A)。恶性细胞具有样本偏性(图1B,C)，而非恶性细胞在患者之间没有明显差异(图1B)。接下来，作者根据恶性细胞中2091个昼夜节律基因(CRGs)的表达进行加权基因共表达网络分析(WGCNA)，识别出与样本来源和TNM分期相关的包含358个CRGs的模块(图1D)，并对其进行了功能注释(图1E)。

接着作者基于这些基因的表达对恶性细胞的CRD评分进行了评估（图1F）。CRD评分在远处转移的样本中较高；根据CRD评分将恶性细胞分为高和低CRD组，通路富集分析显示糖酵解、G2M检查点和MYC靶通路在高CRD组中富集(图1G)。相比之下，DNA修复、p53和凋亡通路在化疗后的样本中更加明显(图1H)。

2. CRD与酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗应答相关

接下来文章研究了CRD与TKI治疗应答的关联。研究对包含22例接受TKI治疗患者的21 604个细胞的数据集进行了分析，根据时间点将样本分为3组，分别为开始靶向治疗前(TN)、完全或部分缓解(RD)状态和疾病进展(PD)状态。研究将这些细胞注释为免疫细胞、成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞(图2A)，然后使用inferCNV推断出了4258个恶性细胞，接着比较TKI组间的细胞亚群分布，结果发现恶性细胞具有高度的TKI特异性，并且主要富集在PD样本中(图2B,C)。接着为了评估CRD对TKI治疗的影响，研究基于358个节律基因的表达计算了恶性细胞的CRD评分(图2B)，结果观察到高CRD组的恶性细胞主要来自PD样本(图2D)。此外，转移性和晚期患者的CRD评分也较高(图2E)。接着研究根据CRD评分将22例患者分为高CRD组和低CRD组，结果观察到高CRD患者的总体TKI应答率显著低于低CRD患者(图2F,G)。接着研究根据CRD情况和TKIs结局(应答vs.无应答)分层进行基因功能分析，其中GO分析显示糖酵解、氧化磷酸化和自噬通路在伴高CRD的PD和TN患者中同时富集(图2H)。此外，研究观察到细胞因子分泌信号通路中主要在高CRD组中激活，与TKI结局无关(图2I)。相反，在无应答者(PD)和应答者(RD)之间研究也观察到糖酵解和细胞衰老信号的显著差异(图2I)，而葡萄糖和脂质代谢相关基因则在高CRD患者的恶性细胞中高表达(图2G)，其中G6PD, HK2, ALOX5和DGKA的表达水平与CRD评分正相关(图2J,K)。

3. CRD重塑了TME内的细胞间相互作用和细胞因子信号转导活性

这一部分作者对CRD与肿瘤微环境中的细胞相互作用进行了分析。研究根据加权的输入及输出信号构建了细胞通讯网络，观察到恶性细胞趋化因子的总体表达水平与CRD有关(图3A)，且高CRD组具有显著的抑制恶性细胞产生的共刺激信号(图3B)，此外LGALS9、FAM3C和CD47等共抑制细胞因子也在高CRD细胞中显著升高(图3C)。研究还发现T细胞亚群与巨噬细胞之间的互作是由CCL20介导(图3D)，且不同CDR组的M1和M2巨噬细胞对T细胞表现出不同的共抑制和共刺激信号效应(图3E,F)。研究也发现诱导一组协同调节的受体配体会增强CD8⁺ T细胞与低CRD细胞的互作(图3G,H)。接下来研究分析了CRD是否在单细胞水平调节细胞因子信号活性，结果如图3I所示研究识别了在高CRD恶性细胞中被激活的36个细胞因子相关通路。进一步研究也观察到细胞因子信号在CRD高低组之间的差异激活会导致T细胞及巨噬细胞内的协同调节效应(图3J)。

4. 使用组织转录组数据集验证CRDscore的性能和鲁棒性

这一部分研究使用组织数据对CRDscore的效能进行了验证。研究首先在接受或未接受昼夜节律失调治疗(CDT)的小鼠模型中收集了独立的基因表达数据，结果在3个CDT样本的CRD评分高于正常样本(图4A)。此外，治疗组CRD评分表现出与信号通路特征相关(图4B)。接着研究使用ESTIMATE评估了TCGA中LUAD样本的免疫细胞浸润，结果发现低CRD样本中，免疫评分和基质评分的水平显著高于CRD样本。另一方面，肿瘤纯度在CRD样本中显著富集(图4C)。进一步研究也观察到CRD评分和Treg和Th2细胞的浸润丰度之间正相关(图4D)，研究在低CRD样本中观察到抗原呈递和共刺激免疫调节普遍上调(图4E)，而缺氧、EMT和糖酵解通路则在高CRD样本中富集(图4F)。

5. 在LUAD等多种癌症中CRD与不良预后相关

这一部分研究在多个癌症中分析了CRD评分与临床结局的关联。研究首先在5个独立的LUAD队列中构建了平滑的总生存期(OS) HR曲线(图5A-C)，并以CRD评分的截断值作为参考线，结果观察到CRD与OS有关。接着为了进一步评估CRD评分的预后价值，研究使用Kaplan-Meier生存分析比较了不同CRD评分组之间的OS(图5D-F)。在LUAD队列中，研究观察到高CRD患者的OS明显差于低CRD患者。进一步的亚组分析也表明所有样本中，CRD高低组的OS存在显著差异(图5G)，表明CRD评分是有价值的肺腺癌预后指标。此外，研究也分析了来自TCGA的包括乳腺癌(BRCA)和前列腺癌(PRAD)在内的22种癌症的7500多例样本，结果发现CRD评分在大多数癌症类型中的分布相似(图5H)。然后，研究以评分的中位数为阈值，将所有患者分为CRD高低组(图5I)，观察到肿瘤样本中的CRD评分显著高于邻近正常组织(图5J)。同时，在LUAD、胰腺癌(PAAD)、间皮瘤(MESO)和葡萄膜黑色素瘤(UVM)等四种癌症类型中，高CRD患者的单因素和多因素生存模型均与更差的预后相关(图5K)。

6. 构建一个预测ICB免疫治疗应答的昼夜节律相关模型

接下来研究在两个独立的接受化疗的LUAD队列中检验了CRD评分预测免疫应答的能力。研究观察到低CRD患者的治疗效果显著较好，其5年生存率是高CRD患者的2倍以上(图6A,B)。此外，CRD评分可以评估NSCLC患者的TKI应答，如图6C所示与低CRD患者相比，高CRD与显著较差的无进展生存期有关。研究还通过预测BRCA患者对化疗的反应来评估CRD得分的性能(图6D)，结果在接受化疗的BRCA队列中，CRD评分在分类方面表现良好(图6D)。接着研究根据突变特征将LUAD样本分层为时钟样或非时钟样亚型，结果观察到时钟样信号与LUAD患者的OS没有显著相关性(图6E)，接着研究将患者分为“clock‐like mut&高CRD”和“non‐clock‐like mut&低CRD”组，结果观察到“clock‐like mut&高CRD”组患者的生存率显著低于另一组(图6E)。接下来研究基于358个CRG表达谱，使用LASSO和SVM‐RFE算法识别了包含23个CRG的基因集(图6F)，并构建了一个基于五倍交叉验证的广义线性回归模型(CRGm)来预测14个独立的癌症队列的治疗应答。结果在所有队列中观察到应答(RD)样本的CRGm预测指数均高于无应答(NR/PD)样本(图6G)。此外，作者将CRGm的性能与其他已发表的基于mRNA表达的免疫治疗应答预测指标进行了比较 ，结果观察到CRGm的总体性能比其他预测指标更稳健和准确(图6H-J)。

7. 褪黑素可以减弱CRD和癌细胞的侵袭性

最后一部分研究通过体外实验来验证CRD与癌症的关联。研究首先使用RT - qPCR检测了两个NSCLC细胞系(A549和H1299)和一个支气管上皮细胞系BEAS - 2B中昼夜节律核心基因的表达变化，结果观察到CLOCK在H1299细胞中表达显著增加(图7A)。接着研究检测了癌细胞的侵袭性，使用siRNA (siCLOCK)敲除CLOCK或褪黑素预处理后，观察到细胞侵袭性受损(图7B)。接着研究通过RNA测序评估了基因表达模式，结果识别基因的PCA展示治疗组明显聚类，且褪黑素组的差异远大于siCLOCK组(图7C，D)。接着研究对差异表达基因的GO分析揭示了接受抗CRD处理的细胞与昼夜节律、能量稳态和氧化应激反应等相关(图7E)。研究也观察到CRD评分与EMT标志物之一的SNAIL的转录水平呈正相关(图7F)，此外CRD评分和SNAIL的蛋白水平可以被褪黑素显著抑制(图7G)，表明CRD状态和癌细胞的侵袭能力被这种抗CRD处理减弱。

到这里这篇文章的主要内容就介绍完了，研究使用单细胞及组织数据，计算了肿瘤的节律紊乱得分，并分析了其对肿瘤免疫微环境通讯、临床结局及免疫应答等的影响，对节律与癌症的关联进行了全面分析，内容丰富，逻辑清晰，有理有据，十分值得我们参考。