大家好呀，今天让我们来看一篇题为转录组和单细胞分析揭示免疫抑制微环境在促进胶质母细胞瘤进展中的贡献文章，文章于今年一月发表在《Frontiers in Immunology》（IF =8.786）上，让我们来一起学习一下吧！

一、摘要

胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）患者经常表现出严重的局部和全身免疫抑制，限制了免疫治疗策略的疗效。GBM肿瘤免疫抑制机制的建立是个体化免疫治疗成功的关键。本研究成功地发现了GBM的免疫抑制亚型及其形成的主要细胞类型、信号通路和分子，为今后改进GBM的个性化免疫治疗提供了新的线索。

二、技术路线

A、通过对TCGA-GBM和CGGA队列基因共存、高危组和低危组得到的DEGs以及IDH1突变与野生型的比较等三个角度获得的基因集进行功能富集分析，确定了与GBM患者预后不良相关的五个途径。

B、构建GBM与肿瘤微环境（TME）相关的功能基因标签。根据这些特征的活性分布，将GBM患者分为四个不同的亚型，并发现免疫抑制亚型。

C、在三个scRNA-seq数据集中验证免疫抑制亚型的Hub基因表达，并确定了与其显著相关的细胞类型、某些细胞类型之间的相互作用。（图1）

三、结果

1、细胞因子-细胞因子受体相互作用是GBM的危险因素

作者对所有基因进行单因素Cox风险回归分析，在TCGA-GBM队列和CGGA队列分别发现了1264、2681个基因与生存相关。取交集共86个基因，KEGG富集结果皆被前人证实过。为了进一步验证这些基因在GBM进展中的预测作用，作者基于最小绝对收缩筛选得到8个基因并使用LASSO回归构建风险模型。高危组患者预后较低危组差，模型预测患者生存期的AUC值在1年、3年和5年均大于0.75，表明风险模型具有较高的预测能力。在TCGA-GBM队列中计算高、低危险组之间的差异表达基因（DEGs）并进行KEGG富集，其中细胞因子-细胞因子受体相互作用是最重要的途径。与野生型患者相比，异柠檬酸脱氢酶(IDH1)基因在GBM患者中是一个复发性突变与良好的预后结果有关。上述高危患者中富集的、上调的通路在IDH1突变样本中下调，这进一步验证了他们在GBM中的促肿瘤特性。有趣的是，细胞因子-细胞因子受体相互作用再次位于IDH1突变和野生型患者之间富集通路的顶端。（图2）

2、异质性的肿瘤微环境（TME）成分与促肿瘤途径相关

TME由成纤维细胞、内皮细胞、周细胞、白细胞和细胞外基质组成。为了对TME进行分类，作者构建了代表肿瘤主要功能成分和免疫、间质及其他细胞群体的基因表达签名(GES)。根据生物学背景知识从高危患者的上述上调通路中筛选出5条促瘤通路。分析5条通路与其他TME信号（如MDSC和单核细胞的基因表达标签GES）的相关性，5条促瘤通路与其他促肿瘤或血管生成相关信号呈显著正相关，与抗肿瘤相关信号呈显著负相关。通过对这些TME相关特征的单因素Cox回归分析发现大多数特征具有高HR。综上所述，作者综合分析了GBM的TME基因特征，发现异质性的TME成分与肿瘤促进途径有关。

3、GES分类识别GBM免疫抑制亚型

根据所选GES在TCGA-GBM数据集中的表达活性，采用层次聚类方法将患者分为4个亚型并根据肿瘤进展(P)、免疫浸润(IE)和两者同时表达(P/IE)对亚型进行定义。P亚型有较高的肿瘤进展特征和较低的淋巴细胞浸润，存活率最差。然后作者从免疫抑制、免疫检查点阻断（ICB）、高频突变分布、细胞浸润等几个方面评价了IE和P亚型之间的差异。图3C绘制了免疫抑制因子的表达热图，可以看到这些基因在亚型P中高表达；图3D绘制了四个亚型高频突变的分布，IDH1突变为IE型具有较好的临床结局与上述结果一致。肿瘤细胞通常上调ICB基因表达以逃避免疫系统。图3E绘制了抑制性ICB在P型细胞中的表达。P亚型表现为高水平的髓系细胞浸润，其他亚型表现为高水平的淋巴细胞浸润（图3F）。使用CGGA数据集验证结果与上述一致，不一致的是CGGA数据集中IDH突变不主要分布在IE型，也分布在IE/P型。总之，作者在TCGA-GBM和CGGA队列中鉴定了免疫抑制亚型和淋巴细胞亚型，并发现了它们相反的生物学特性。（图3）

4、GBM亚型代表了异质性的功能基因模块

使用WGCNA识别亚型特异的功能模块，计算模块基因与亚型之间的相关性，P亚型特异的模块为7、5和18；IE/P2亚型特异模块为113；IE/P1亚型特异的模块为10；IE亚型特异模块为15、8和11。对亚型特异性模块进行功能富集分析并依据P值筛选每个模块的前5条途径。M5富含参与炎症反应的基因，包括细胞因子相互作用、趋化因子信号传导和Th17细胞分化。M7富含与血管生成相关的基因。M18富含参与细胞对低氧反应和碳代谢的基因。提示这三种功能相关的基因参与了免疫抑制微环境的形成。IE/P2和IE/P1亚型均与代谢有关。IE亚型主要富集于突触和单一转导相关通路，这表明IE亚型的神经系统活性较高。

单因素Cox回归分析各模块基因表达与患者生存的关系。P<0.05、HR>1促肿瘤相关基因，HR<1抗肿瘤相关基因。促肿瘤基因比例>0.5预后不良相关模块，抗肿瘤相关基因比例>0.5预后相关模块。将9个亚型特异性模块分为7个预后不良模块和2个预后良好模块，各亚型特异性模块的存活相关基因缩写为ssMSGs，对hub基因进行生存分析得到主要位于M5和M7(P亚型）的24个hub基因。通过对Hub基因在不同基因模块中的共表达分析，确定了M5中前15个Hub基因包括LAPTM5、NCKAP1L、PTPN5、SYX和SIGLEC9，这与我们总结的危险通路一致。此外，在免疫治疗队列中这15个hub基因的特征与较差的临床结果相关（图4f），与M5的促瘤功能一致。值得注意的是，在单细胞数据集中，我们证实M5、M7和M15的hub基因也是特定细胞类型的标记基因。M5中的CSTS、CD68、NOD2是巨噬细胞的标志物；M7中COL6A2和ITGA5与血管细胞有关；M15中的Oligo2是少突胶质细胞的标志物。这一结果表明，在GBM的发展过程中，特异的细胞类型应该代表不同的功能模块。（图4）

5、巨噬细胞和小胶质细胞操纵GBM促瘤基因模块

作者分析了3个GBM单细胞数据集(GSE117891、GSE84465和GSE163120)中9个亚型特异模块ssMSGs的表达活性。用“AUCcell”计算单细胞中ssMSGs的表达活性。在P亚型相关基因中：M5在髓系细胞包括TAMS、小胶质细胞、单核细胞和DCs中高表达；M7主要在血管中表达；M18在血管、髓细胞和肿瘤细胞表达。IE亚型相关基因位于OPCs和神经元。结合这些结果，我们认为巨噬细胞操纵M5，血管相关细胞参与M7，而OPC细胞调节M15。（图5A-D）

6、细胞-细胞相互作用

作者比较了肿瘤细胞与正常细胞的相互作用强度，发现在所有细胞类型中巨噬细胞都表现出与肿瘤细胞的高度相互作用；作者同时绘制了免疫细胞之间的相互作用网络。有趣的是，当我们通过细胞因子相关途径的表达来划分细胞时，发现表达更高细胞因子途径的巨噬细胞与DC和T细胞的相互作用更强，这可能强调了它们的促肿瘤机制。类似地，我们发现具有较高细胞因子途径表达的小胶质细胞倾向于与DC，巨噬细胞，单核细胞和T细胞相互作用。Tregs与细胞因子高的亚型之间的相互作用更强，这可以重塑免疫抑制微环境。总之，我们确定了在GBM中操纵不同基因模块的特定细胞类型，主要关注巨噬细胞和小胶质细胞与微环境中其他细胞类型的相互作用。（图5E-F)

7、巨噬细胞和小胶质细胞通过与Tregs相互作用形成免疫抑制微环境

为了进一步确定GBM患者巨噬细胞和小胶质细胞相互作用的关键介质，基于配体-受体对的表达和下游靶点，作者选择Tregs进行分析，发现巨噬细胞和小胶质细胞可以通过粘附配体-受体对ICAM1-IL2RG和ITGAM-ICAM2直接接触Tregs。此外，巨噬细胞和小胶质细胞通过EBI3、CD86和TNF的表达增强Tregs的活化因子活性，诱导Tregs表达IL27RA、CD28、TNFRSF1B、Fas、ICOS和免疫检查点CTLA4。 巨噬细胞和小胶质细胞通过CXCL16-CXCR6、CCL3-CCR5、CCL2-CCR5对增强Tregs的募集。然后作者评估了巨噬细胞或小胶质细胞上的哪些配体最有可能调节Tregs，合并GSE163120和GSE117891数据集确定了七个配体基因。图6d展示了前15个hub基因与这些配体之间的调控网络。 SPI1可能是TNF的上游调节因子，GPSM3可能调节C3、CXCL3、CXCL16和CXCL2等一系列细胞因子和趋化因子的表达。总之，作者发现上游调节因子是如何调节巨噬细胞和小胶质细胞上配体的表达的，配体是如何与Tregs上的受体相互作用的，以及这些相互作用如何形成GBM的免疫抑制微环境。（图6）

三、小结

本篇文章结合转录组和单细胞数据对胶质母细胞瘤划分亚型，并成功地定义了免疫抑制亚型，不同类型患者的生存率有统计学差异。本文有4个亮点：1、作者构建了代表肿瘤主要功能成分和免疫、间质及其他细胞群体的基因表达签名(GES)，并利用GES进行亚型的划分。2、使用WGCNA分析对亚型功能及形成机制进行补充。3、在单细胞验证集中，作者利用“AUCcell”评估各亚型特异性模块的生存相关基因活性评分，观察这些基因在哪些细胞中表达升高，从而将细胞类型与功能模块相联系。4、作者通过对单细胞数据集细胞-细胞相互作用分析揭示了GBM的免疫抑制微环境的形成机制。文章脉络清晰，得到的结论可前后相互印证，感兴趣的小伙伴可以进行复现尝试哦~

参考文献：Ni L, Sun P, Zhang S, Qian B, Chen X, Xiong M, Li B. Transcriptome and single-cell analysis reveal the contribution of immunosuppressive microenvironment for promoting glioblastoma progression. Front Immunol. 2023 Jan 5;13:1051701. doi: 10.3389/fimmu.2022.1051701 . PMID: 36685556; PMCID: PMC9851159.