小伙伴们大家好哇!今天小编给大家介绍的是今年7月发表在Cancer Discovery(IF=38.272)的一篇单细胞文章。作者通过单细胞转录组测序和T细胞受体(TCR)测序揭示了胰腺导管癌患者肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的发育轨迹,生信分析一看就会,重点在于作者的实验设计及丰富的生物学知识!快来和小编一起看看吧!
一.研究背景
胰腺导管腺癌(PDAC)占所有确诊胰腺癌的85%,5年生存率仅为9%,化疗和手术仍然是主要的治疗选择。免疫治疗是一种新的治疗策略,在多种癌症中实现了良好的临床治疗效果。由于癌症患者对免疫治疗的反应各不相同,了解与临床反应相关的肿瘤微环境(TME)的潜在免疫状况是很重要的。尽管存在反应性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL),但迄今为止PDAC对免疫疗法缺乏反应,并且迫切需要改进治疗方案。单细胞RNA测序(scRNA-seq)已成为一种强大的工具,通过在同一细胞中结合转录组谱和T细胞受体(TCR)库,来研究复杂细胞群(如TIL)的异质性。作者之前的工作研究已表明,肿瘤反应性PDAC TIL体外扩增用于过继细胞治疗(ACT)的可行性。因此,作者在本篇文章通过使用scRNA-seq和TCR测序相结合的方法对PDAC患者新切除的肿瘤和癌旁的组织进行分析,从而描述PDAC TIL的特征,以期了解TIL在PDAC的细胞免疫治疗中的应用。
二.主要结果
1.T细胞单细胞转录组数据的生成及分析
为了描述PDAC中的TIL亚状态,作者对7个PDAC癌症样本和一个癌旁的胰腺样本进行了单细胞RNA测序,重点关注了CD3+TIL(图1A)。除此之外,作者还整合了另外的两套PDAC单细胞数据集(MDA2数据集:26例PDAC,10例癌旁;PUMCH数据集:24例PDAC,11例正常)。整合后,共39694个T细胞,来自57个PDAC样本和22个癌旁/正常样本。经过聚类分群,共鉴定出5个CD4+TIL,7个CD8+TIL和一个周期性(cycling)T细胞亚群(图1B)。
为了了解每个T细胞簇的生物学功能,作者研究了每个簇的高表达基因和特定的转录因子表达。如图1C结果显示,不同T细胞簇具有显著不同的细胞编程状态差异:由于FOXP3、IL2RA(CD25)、CTLA4和调节性T细胞(Treg)相关转录因子IKZF2和IKZF4的表达,CD4-FOXP3簇被归类为Treg;CD8+TIL群体中,通过TRM转录因子ZNF683的表达、TRM相关基因XCL1和GNLY的表达以及KLF2的低表达,CD8-ZNF683集群似乎是一个TRM样群体;此外,高表达效应细胞标记物GZMB和PRF1和转录因子TBX21,被鉴定为细胞毒性CD8+细胞状态;其中一组CD4-CXCL13和CD8-CXCL13显示转录因子RBPJ和趋化因子CXCL13的表达,被认为是功能失调T细胞表型;另一组CD4-CCR7和CD8-CCR7/IL7R,共同表达转录因子LEF1和TCF7,被定义为中心记忆T细胞表型(Tcm)。
在整个数据队列中,不同T细胞的频率也显著不同(图1D)。此外,为了确定细胞状态是否为肿瘤组织特异的,作者在具有匹配肿瘤和癌旁组织样本的10名患者子集中比较了细胞状态组成,结果表明:CD4-FOXP3和CD4-CXCR4细胞状态在肿瘤组织中比癌旁组织中富集,而CD8-CXCR6/IL7R和CD8-GZMB/PRF1细胞状态在癌旁组织比肿瘤组织中富集(图1E)。
2. 通过轨迹图揭示TIL转录组状态的转变
由于T细胞具有极强的在不同功能和分化状态之间转换的能力,作者在此应用伪时序推断来理解已识别的细胞状态之间的关系。因为CD4+和 CD8+T细胞在胸腺内选择之外没有发育相关性,所以作者分别对这些主要亚群进行轨迹分析(图2A、B)。对于CD8+TIL,推断CD8-CCR7/IL7R TCM状态和CD8-CXCR6/IL7R状态在轨迹上相关;该轨迹也表明,CD8-GZMK可能是介于CD8-GZMB/PRF1细胞毒性细胞状态和CD8-CXCL13潜在功能失调状态之间的中间细胞状态;此外,CD8-MX1细胞状态与其他细胞状态的关系似乎不明确,因为它们没有发生在轨迹的一个分支上,这表明它们可能是一个单独的状态(图2A)。作者还发现,除CD8-CXCR6/IL7R外,来自肿瘤和癌旁样本的CD8+ TIL的贡献是重叠的(图2C)。从伪时间分析得出的相似性和近端状态转变可能表明,肿瘤外发现的TIL群体(CD8-CXCR6/IL7R)可能有转变为肿瘤内的状态(CD8-ZNF683)。
接下来作者对CD4+TIL也进行了相同的轨迹分析(图2B)。结果显示CD4-CXCR4细胞状态与TCM簇相邻,与CD8+TIL相比,由于CD4-TIL每个细胞状态具有更高的细胞密度,所以CD4+TIL的细胞状态转变具有更高的可信度。与CD8-MX1类群相似,CD4-MX1簇与其他簇之间的关系尚不清楚,这可能是由于其样本量较小。与CD8+ TIL不同,CD4+ TIL在肿瘤与癌旁之间具有同质性(图2D)。
为了确定T细胞状态在同一PDAC样本中共发生的程度,作者以逐个患者的方式对所有肿瘤样本的细胞状态频率进行了Spearman相关性分析,结果表明:如果患者的A类细胞比例较高,那么他们的B类细胞比例也会较高,高度相关的CD8-MX1和CD4-MX1细胞状态的频率之间存在显著的相关性(图2E)。虽然CD4和CD8的这种细胞状态与其他细胞状态表达的许多基因相同,但只有CD8-MX1与CD4-FOXP3显著正相关,证实了这些MX1状态是独立的,但同时也证实了富含干扰素的TME可能是它们显著相关的原因,干扰素会影响这些细胞状态。CD8-CXCL13和CD4-CXCL13细胞状态之间存在显著相关,再加上CD8-CXCL13细胞状态与周期性T细胞群体之间存在显著相关,提示CXCL13细胞状态可能是TIL的增殖群体,尽管可能存在功能障碍。几种T细胞状态也呈现出了反比关系:例如CD8/CD4 CXCL13群体与CD4+ CXCR4效应群体呈显著负相关,提示T细胞功能异常的TME在某些效应群体中含量较低。
3. TCR克隆型分布显示扩增的TIL克隆可以占据多种细胞状态
为了进一步了解T细胞状态的潜在功能以及它们之间的关系,作者对7个样本(MDA1队列)的同一细胞子集进行了单细胞TCR测序和转录组分析。通过量化MDA1数据集与更大数据集之间的基因重叠,进一步验证了细胞状态间的相似性(图3A)。较小的MDA1队列的UMAP图提示了聚类的稳健性,在CD8+和CD4+TIL的UMAP图中,原始细胞状态标签都保留了共定位(图3B、C)。为了评估MDA1样本集中采样偏倚的可能性,作者分析了每个样本中不同细胞状态的比例(图3D、E)。除了CD8-CXCL13细胞状态主要来源于一个样本外,其与细胞状态均不受患者所主导。
因为在多个细胞状态中发现的克隆型(这里称为细胞状态共享)可能表明这些状态之间的过渡,于是作者分析来自同一个单细胞的TCR序列和转录组信息,以确定细胞状态之间的关系。对CD8+TIL和CD4+TIL的细胞转录状态及其克隆频率的可视化显示,大多数克隆在低频率下检测到,表明在肿瘤部位的增殖有限(图4A、B)。Circos图的每条线都代表一个T细胞克隆,其中Circos图外圈灰色线的高度与携带该TCR的细胞数量成比例。图4A中的CD8转录组状态显示,作者发现在CD8-GZMK细胞状态(蓝绿色)中,扩展的TIL克隆型(即在肿瘤组织中发现多个拷贝)具有高度的细胞状态共享(图4C)。对于CD8-GZMK细胞状态,18/40个TIL克隆型也被分配到至少一种其他细胞状态,例如CD8-GZMK和CD8-ZNF683共享的6个克隆型(图4D)。
在CD4+ TIL中,作者只发现了非常有限的克隆性簇共享,这表明肿瘤增殖能力较弱(图4B、E)。这对于CD4-FOXP3细胞状态(红色)尤为显著,在伪时序图(图2B)中可以看到,它与轨迹的其余部分的连接非常弱。这种细胞状态和其他CD4状态之间缺乏TCR共享,进一步支持了这些细胞是先天的而不是诱导的Tregs的观点。
4. 克隆扩增发生在CD8+ TIL细胞而非CD4细胞
为了量化每个簇内克隆扩增的程度,作者通过计算患者CD4+和CD8+TIL的Gini指数来测量克隆频率的均匀性。作者发现在基尼系数中值接近1的情况下,CD8+ TIL簇在患者中显示出比CD4+ TIL更高程度的寡克隆性,然而,作者利用Shannon多样性指数(另一种同时考虑克隆均匀度和克隆型丰度的多样性指标)时,作者观察到CD8+ TIL的多样性总体上低于CD4+ TIL(图5A)。
当通过基于细胞状态分析时,作者观察到一个相似的模式,所有CD4+ TIL状态表现出比大多数CD8+ TIL状态更低的克隆性(图5B)。CD8+TIL的高克隆性主要来自于CD8- GZMK、CD8- GZMB/PRF1和CD8- CXCL13细胞状态;CD4+ TIL不一定是这样,因为CD4细胞状态(CD4-FOXP3)的寡克隆扩增几乎是最高的。CD8- GZMK、CD8-ZNF683、CD8-GZMB/PRF1和CD8-CXCL13在TME中有最大比例的克隆扩增细胞,表明其克隆扩增很稳定。这与CD8-CXCR6/IL7R细胞状态相反,其中仅有四分之三的克隆被检测到一次(图5C)。综上所述,这些指标表明,尽管CD8+TIL群体与CD4+TIL具有相似的克隆型丰富度水平,但CD8+效应群体的克隆性更高,这表明有选择性的TIL克隆参与了对肿瘤的免疫应答。
5. TIL转录组分析和TCR测序揭示了它们在体外繁殖后的命运
对于MDA1队列,每个组织的一块被用于离体TIL培养。然后将培养的TIL用于转录组和TCR单细胞测序(图6A)。图6B展示了分群情况,图6C展示各个细胞分群的基因表达情况。
以细胞为基础的癌症免疫治疗领域的一个主要目标是识别和选择最佳的T细胞亚型,以提供最有效的过继细胞治疗。作者发现,无论其在组织中的初始转录组细胞状态如何,TIL克隆型在多种生长细胞状态下均被鉴定出来,其中大多数为培养产物中的G1-CD8-CD27亚型(图6D)。尽管在任何最终生长的细胞状态和特定的初始PDAC TIL群体之间缺乏联系,但有迹象表明,组织中的某些TIL群体优先生长(图6E、F)。来自CD8-GZMK、CD8-ZNF683和CD8-GZMB/PRF1细胞簇的T细胞克隆在体外优先扩增,而来自CD8-CXCL13细胞簇的T细胞克隆相对于其在组织中的初始频率下降(图6E)。CD4+ TIL表现出类似的模式,主要是CD4+效应细胞扩增,而Treg细胞不扩增(图6F)。作者提出了一个PDAC TIL的组织关系和分化轨迹的模型,以及它们在体外培养的每个成分群体中无限制扩展的模型(图7)。
到这里这篇文章就介绍完啦,总结一下:作者通过对PDAC患者的癌症样本和癌旁进行单细胞RNA测序和TCR测序,并将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)分为CD8+和CD4+TIL分别推断了其分化发育轨迹;通过TCR测序分别识别了在两种TIL中的共享及独有的克隆扩增。乍一看分析极其简单,但是巧妙在作者在分析scRNA-seq数据时结合了公共数据,扩大了样本量,使文章数据更加饱满。更加值得一提的是,作者对自己的样本不仅仅进行了测序,还预留了一部分组织进行了体外培养及测序分析,再体外培养印证作者的结果以及分析与患者体内细胞状态的不同,紧扣过继细胞治疗的主题。全文生信分析并不难,大量的生物学知识使整个文章丰富饱满,感兴趣的小伙伴可以拜读一下原文哦!