癌前病变出现在癌症发生之前且有助于癌症的发生,因此了解癌前及癌变阶段的异常表型对于探索癌症发生的分子机制并开发早期诊断及预防策略至关重要。今天小编给大家分享一篇今年3月刚刚发表在Cell Discovery(IF:30.079)杂志上使用单细胞和空间转录数据解析口腔鳞状细胞癌早期及癌前病变的文章。
Single-cell and spatial dissection of precancerous lesions underlying the initiation process of oral squamous cell carcinoma
口腔鳞状细胞癌起始过程中癌前病变的单细胞和空间解析
一.研究背景
口腔黏膜癌前病变是口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)发生的重要因素。然而,目前关于癌症起始阶段的细胞组成和空间组织是如何促进人类OSCC发生的仍不清楚。因此小编今天介绍的文章就对OSCC癌前病变及起始阶段的细胞形态和作用进行了刻画,这对理解整个OSCC发生过程至关重要,并有助于制定癌症治疗策略。
二.文章摘要
研究分析了来自9个样本的极早期OSCC、癌前病变,以及匹配的正常口腔黏膜组织的单细胞转录(scRNA-seq)及空间转录(ST)数据。结果研究识别出了有利于OSCC发生的异常上皮基因表达。研究也发现不同的成纤维细胞、单核细胞和调节性T细胞亚群都会参与微环境的重塑。此外,研究在癌前病变周围观察到一种独特的免疫抑制性单核细胞亚群和VEGF信号通路的空间转换调控会共同促进癌症发生。
三.文章的主要内容及结果
1. 早期OSCC肿瘤、口腔白斑和正常区域活检样本的scRNA-seq和ST分析
研究首先对不同区域样本的scRNA-seq和ST数据进行了介绍。研究收集了9个人的早期OSCC (T)、口腔白斑(DN)及正常区域(N)的10个组织样本并进行了scRNA-seq分析和ST分析(图1a、b)。此外,研究分析了苏木精-伊红染色(H&E)并由专家标记组织学区域的图像数据(图1c)。经过质控后,RNA-seq共分析了52721个细胞,其平均测序深度为43905个读数(reads;图1d-f)。接下来研究在表达标化和主成分分析(PCA)后,将这些细胞聚类成11个亚群,并根据标记基因对这些亚群进行了注释(图1d-f),其中包括口腔上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、B/浆细胞、髓系细胞、T细胞、肌细胞等(图1d,e)。此外,研究在ST分析中对26773个斑点(spot)进行了测序,且对N、DN、T和薄层区域的ST数据进行细胞类型标记评分,并在热图中展示了细胞类型的占据和富集情况(图1g)。研究观察到ST数据中排名最高的是上皮细胞,其次是成纤维细胞,髓系细胞和T细胞(图1g),进一步研究也在P1样本中展示了特定细胞类型标志物的代表性表达特征(图1h)。
2. 上皮细胞的高拷贝数变异(CNV)、FRA和mTORC1信号评分与OSCC发生的相关性
这一部分研究对上皮细胞与OSCC发生的关联进行了分析。研究首先对上皮细胞进行了重聚类,分为C1和C2两部分(图2a),其中大多数亚群位于C1,一小部分亚群分散分布于C2,且C2中的大部分细胞来自T区域(图2a)。接下来为了区分恶性细胞和非恶性细胞,研究对上皮细胞进行了拷贝数变异(CNVs)推断,结果发现DN和T区域的上皮细胞中CNV逐渐富集(图2b)。接下来研究在ST中观察到DN和T区域富集糖酵解、缺氧和DNA错配修复等经典癌症通路和标志物(图2c)。此外,研究也在scRNA-seq中观察到EMT、mTORC1、FRA通路在OSCC发生过程中(从N、DN到T组)逐渐富集(图2d),ST数据也揭示了FRA和mTORC1通路相似的变化趋势(图2e, c)。研究也通过细胞互作分析发现在N阶段基质细胞和上皮细胞之间很少有相互作用。然而,从DN期到T期,上皮细胞和周围基质细胞之间频繁的交互,表明DN期上皮细胞的表达和相互作用发生了巨大的变化(图2f)。
3. 识别参与调控OSCC起始过程的起始相关上皮标志物
这一部分研究对参与OSCC起始的上皮细胞标记物进行了介绍。研究首先识别了在OSCC起始过程中上皮细胞中逐渐上调的基因,并将其称为“起始相关”基因(图2g),结果在scRNA-seq数据中识别了8个起始相关基因,同时研究使用ST数据对这些基因进行了确认,这8个基因分别为CTSC、FADD、ITGB4、LGALS1、LY6K、PMEPA1、TFAP2A和TGFβI(图2h, i)。接着研究通过ST特征图和组织学染色证实TFAP2A在上皮细胞中的表达随着OSCC的发生而逐渐增加(图2j, k)。进一步研究在体外类器官中敲低TFAP2A后,发现增殖速度减慢,其他启动相关基因的表达也降低(图2l, m)。
4. Mesen_CAF亚群主导OSCC的起始并且在空间上更接近上皮细胞
这一部分研究对成纤维细胞进行了分析。研究首先将成纤维细胞分为三个亚群:Mesen_CAF、Infla_CAF和cycling_CAF(图3a)。结果观察到Mesen_CAF亚群细胞外基质(ECM)基因(ASPN、POSTN和TNC)和促进间充质的TF (TWIST2)高表达(图3b),且同时富集非经典WNT通路(APCDD1, PMEPA1和WNT5A)和趋化因子标志物(CCL2和IL1R1)(图3b)。而Infla_CAF亚群富集经典基质细胞衍生因子CXCL12,并高表达激素和代谢相关标志物(IGF1和CFD)(图3b)。Cycling_CAF则为较小的群体,富集于细胞增殖相关的MKI67、CDK1和UBE2C基因。研究也观察到这些亚群都表达经典的CAF标记物(图3c, d)。ST和标记染色数据分析也发向在OSCC起始期间,Mesen_CAF标记物表达呈逐渐增加的趋势(图3e-g),并广泛分布于上皮区域,这表明Mesen_CAF可能参与上皮细胞癌变过程(图3e、f)。研究进一步对这两个成纤维细胞亚群的富集分析也发向Mesen_CAF富集于TGFβ, EMT,血管生成和PI3K-AKT-mTOR通路,这些通路之前已经被报道对癌症的发展至关重要,这意味着其在OSCC发生的微环境塑造中具有潜在的作用(图3h)。
5. Mono_INHBA亚群在DN期频繁与CAFs、耗竭T细胞和上皮细胞相互作用
这一部分研究对肿瘤的免疫微环境进行了分析。研究首先使用ST数据分析了免疫细胞的分布,结果发现,LYZ(髓系细胞标记)和CD14(单核细胞标记)富集在全组织切片或切片的DN和T区域(图4a, b)。在髓系细胞亚群,研究观察到DC细胞表现出HLA-DRs+和CD14-特征(图4c),单核细胞高表达CD68和CD14(图4c)。其中Mono_INHBA和Mono_NLRP3为经典的CD14+ CD16 -单核细胞,并高表达单核细胞标志物S100A8、S100A9和VCAN(图4d)。作者根据CD16、CD163和MRC1识别了巨噬细胞,并根据特异标志物将巨噬细胞分为Macro_SELENOP、Macro_APOE和Macro_NRG1三个亚群。scRNA-seq数据分析发现DN区域中Mono_INHBA亚群的平均比例最高,不过有两个个体的Mono_INHBA总体较低(图4e)。研究也通过多重免疫组织化学(mIHC)染色进一步验证了Mono_INHBA的富集在DN阶段(图4f)。研究也观察到Mono_INHBA富集到M2样免疫抑制和血管生成活性(图4g)。此外,研究发现Mono_INHBA在空间上更接近耗竭的CD8+ T细胞(CD8+ Tex),并且它们通过CSF1-CSF1R相互作用(图4h),且Mono_INHBA也通过CD274-PDCD1和PVR/ NECTIN2-TIGIT与CD8+ Tex相互作用,促进DN区域的免疫耐受(图4g, i),Mono_INHBA也与CAFs通信,从而调节其胶原形成和其他间质活性(图4j)。进一步研究通过在口腔白斑类器官中添加THBS1来模拟相互作用,观察到THBS1会促进上皮细胞的增殖和起始相关基因的表达(图4k, l)。
6. Cluster 2-Mesen_CAF、Macro_APOE/NRG1和TNFRSF4+ Treg亚群参与DN向T分期的转变
这一部分研究对触发OSCC发病过程及构成因素进行了探索。研究首先观察到从DN到T每个个体中Mesen_CAF Cluster 2都在T区域明显增加(图5a),该亚群中间充质祖细胞和基质活化标志物高表达(图5b),在ST数据中也一致(图5c)。此外,研究也发现在每个个体中,从DN到T阶段,Macro_NRG1和Macro_APOE的比例增加,在ST数据中也观察到类似的趋势(图5d, e)。研究在scRNA-seq数据中也发向Macro_NRG1和Macro_APOE富集到ROS和血管生成通路(图4g)。ST数据分析则发现M2样巨噬细胞和血管生成通路从DN到T分期呈增加趋势(图5e)。此外,研究也发向这两种亚型的细胞比例与上皮细胞中CTSC的表达水平高度相关(图5f)。这表明上皮细胞CTSC的表达升高可能是Macro_APOE/NRG1募集或分化的原因。研究也发现TNFRSF4(OX40)是FOXP3+和CD25+ Treg亚群之间的显著DEGs(图5g),此外它在IL2-STAT5信号通路中富集(图5h)。ST数据也证实了在OSCC起始阶段,TNFRSF4+ Treg细胞及TNFRSF4表达呈上升趋势(图5i, k, l)。研究也观察到CD8_Tem与TNFRSF4+ Treg细胞的比例从N阶段到T阶段保持稳定或逐渐下降(图5j)。此外没研究在早期OSCC样本中对APOE, CD68, FOXP3和OX40的mIHC染色进一步验证了这些免疫细胞参与了DN向T阶段的转变过程(图5m)。
7. DN期存在VEGF信号通路的空间转换调控
这一部分研究对经典癌症通路VEGFA进行了分析。研究首先通过细胞互作分析发现上皮细胞分泌的VEGFA自DN阶段起就与基质细胞上的受体相互作用(图6a)。从OSCC起始组织的VEGFA染色中,研究观察到VEGFA在N区和DN区上皮的上层高表达(图6b)。接着研究在病理专家的指导下,根据角化过度和不典型增生将N和DN区上皮分为两部分,分别为上皮的上下层(图6c),结果研究发现与N和DN区域的下层相比,VEGFA信号在上层表现出显著的表达增强(图6d, e)。除了VEGFA信号外,研究也在N区和DN区上层观察到了CD68+细胞和CD68+ VEGFA+信号(图6f, g)。
8. 确定的免疫亚群在OSCC发病中的临床相关性
在文章的最后一部分研究对免疫亚群在OSCC发病中的临床相关性进行了分析。研究首先通过mIHC染色证实初发轻度白斑和伴中重度异型增生白斑的微环境中,CD68+和APOE+巨噬细胞、FOXP3+和TNFRSF4+Tregs、VEGFA和TGFβ信号的表达水平不同(图7a, b),其中初发白斑的微环境中,TGFβ信号的表达水平较低,淋巴细胞浸润有限(图7a),相反中度至重度不典型增生的活检中CD68+及VEGFA+单核细胞、TNFRSF4+ Treg以及VEGF和TGFβ1信号则增强(图7b)。接下来,作者在小鼠中建立了癌变模型来探索这些细胞亚群的功能(图7c)。研究发现腹腔注射抗TGFβ和抗PD-1抗体的小鼠在20周时要么表现出肉眼可见的菜花样病变,要么在舌头上表现出相对粗糙的表面(图7d)。在对每组的菜花状病变进行定量后,作者发现所有治疗组与未治疗组相比,显著地表现出较轻的病变,表明这些抗体对OSCC起始具有干预作用(图7e, f)。
到这里这篇文章的主要内容就介绍完了。文章聚焦于口腔鳞状细胞癌的早期阶段,纳入了单细胞转录及空间转录数据,将生信分析与实验相结合,对触发癌症发生的因素及癌症早期的微环境进行了全面分析,内容丰富逻辑清晰,值得我们参考学习。