癌症亚型的鉴定是开发个性化治疗的关键步骤。而经由RNA剪切，可以区分不同癌症亚型，Nature Communication的新论文“A Bayesian model for unsupervised detection of RNA splicing based subtypes in cancers”提出了的无监督亚型判别算法CHESSBOARD，可基于RNA数据中的可变剪切信息进行癌症亚型鉴定。使用该方法对几个白血病数据集进行分析，发现其得出的亚型分类是可重复的，调查了相关的驱动调节因素及已知白血病相关突变的关系，可论证得出分型的生物学意义。CHESSBOARD 的潜在临床应用包括，补充基于突变的诊断分析和发现新的剪接图谱，以改善药物反应的相关性研究。

论文地址：https://www.nature.com/articles/s41467-022-35369-0

Chessboard算法概述

Chessboard的输入，是从患者RNA测序中得到的从患者支持各个基因可变剪接的read条数（图1a），称其为局部剪切变异（LSV）。汇总多个样本的结果，记录每个样本中支持跨越外显子的read的条数，得到可变剪切矩阵。Chessboard算法，会根据可变剪切矩阵，进行聚类，以识别出样本中的不同的亚型（图1b）。算法分为三步，第一步过滤，过滤掉太少的样本中观察到的低表达基因，只保留那些在样本间普遍出现且存在显著差异大基因（图1c），之后的MCMC（马尔科夫链蒙特卡洛）通过对输入数据矩阵的进行阻塞吉布斯采样，以迭代的方式使亚型判断方法具有更高的可行性的可变剪切基因（图1d），之后对分型结果计算边缘后验分布并进行可视化（图1e）。

图1 CHESSBOARD 的流程图

2）Chessboard在癌症亚型区分上的应用

为验证Chessboard的性能，在 beatAML12数据集上测试Chessboard。该数据集包含了急性髓系白血病患者的RNA测序数据，样本量 477，局部剪切变异基因 2299个。该算法检测到一个由217个样本和1910个 LSVs 组成的聚簇（图2a）在另一个白血病数据集Penn HTSC使用Chessboard，可得出相似的结果（图2b）。此外，属于两组数据集中，每个组的LSV中位数高度相关（图2c），说明该方法找到的亚型在不同批次的数据间是稳定的。

图2 BeatAML上使用Chessboard的分析结果

之后验证分型是否具有生物学意义，通过比较chessboard分出的亚型的可变剪切，是否随亚型的不同，具有不同的RNA结合蛋白调节（RPB）模式。与在 ENCODE 的 RBP 敲除实验中观察到的差异剪接中，有17个和chessboard区分出的亚型有关，所有17个RBP之间，都区分度亚型间都存在显著差异（图2d），且其中差异最明显的两种结合蛋白调节基因SRSF1和 U2AF2，已知在癌组织的抗凋亡中发挥功能， 由此指出该算法的分型结果具有生物学意义。图2e是对chessboard识别的LSV，按照用 GSEA v. 4.1.0进行的功能注释，得到的富集基因情况。

3）Chessboard可在新增数据模式下运行

当新数据加入后，可能会产生新的癌症亚型，这就需要亚型算法能够以增量模式运行，通过迭代的方式不断更新分型结果。Chessboard支持进行递归聚类，将前一部分的聚类结果作为已知情况处理。图3a展示了对beatAML 进行递增式计算的结果，最初的结果是所有样本都为未区分（白色），之后是随着算法的迭代，未分类样本所占比例降低，直到所有样本被分为不同亚型。图3a还展示了不同亚型的患者中 FLT3-ITD (p < 0.001) ，NPM1(p < 0.001)和 CEBPA (p = 0.025)三个可变剪切情况差异显著的基因，其中突变富集情况经过置换测试显著对应 p 值。这3个基因的突变已知和AML分型相关，这意味着该方法用于分型的基因具有生物学意义。图3b展示了递归深度对分型的影响，表明该样本只包含2个分型，进一步的递归不会产生新的分型。

图3，使用递归模式在beatAML数据集上测试Chessboard

4）Chessboard的临床应用，预测药物反应

只针对70个与AML用药相关的基因上的可变剪切，使用chessboard分型，可得到和上文分析（图2a）类似的结果（图4a）。这意味着无监督方法chessboard基于可变剪切信号，在不直接捕获的突变时，隐含地捕捉了这些基因的生物学意义。通过图4b中展示的那些基因只在一种亚型中出现，说明了模型具有可解释性，即说明了那些基因上的可变剪切更为重要。图4c展示了该算法可以根据分出的亚型，判定是否可对患者用Sorafenib 治疗的决策树。图4d展示了不同分组患者对Sorafenib的效应率的AUC，不同组之间差异显著，图4c的决策树可解释36.8%的差异。其中表现出良好药物反应的组(FLT3-ITD + 和背景)富集异常剪接(55/66例患者) ，而反应差的组(FLT3-ITD-和信号)富集正常剪接(152/169)。 图4e具体展示了两个亚型中的可变剪切事件发生在那个外显子上，之后的散点图展示了可变剪切与基因表达率之间的关系。以上分析说明，可基于chessboard预测癌症患者的药物效应，从而指导个性化用药。

图4 chessboard预测临床反应的结果

5）CHESSBOARD对复杂亚型的区分

之前研究发现在儿童和成人的急性白血病（AML）中，存在很多遗传差异。将 CHESSBOARD 应用于由 TARGET 儿科 AML 和 beatAML 样本组成的联合数据集，分出了五个亚型（图5），其中C1，C2和 C4代表儿童 AML，C3和 C5代表成人 AML 。一部分可变剪切事件（ LSVs） 分别对成人(绿色)和儿童(蓝色) AML 是独特的。其他 LSVs 或者在每种疾病类型的亚型之间共享(黄色) ，或者仅对一种疾病的单一亚型(紫色)独有。许多这些剪接变异发生在基因，通常儿童和成人疾病类型对应的差异突变基因。

将 CHESSBOARD 应用于 TARGET b-ALL (B 细胞急性淋巴性白血病)数据(样本 = 517，LSVs = 1562) ，这是一种明显与AML不同类型的白血病。与 beatAML 数据集的结果相比，该算法识别出了五个具有明显更复杂的聚簇。值得注意的是，一个确定的亚组富集的患者，其中RUNX1-ETV6融合阴性者有高复发率，该突变经常被用作一个积极的预后标志。这表明与该突变有关的剪切标记也可被视作是临床指导指标。

图5 CHESSBOARD 在AML 和b-ALL上的亚型区分

总结

CHESSBOARD是第一个用于异质 RNA-seq 数据中，基于 RNA 剪接进行聚类的定制算法。通过在白血病患者RNA seq数据的应用，展示了其可用于药物反应预测，患者预后分类。该算法分型依据的基因，对应已知的相关通路，具有生物学意义。将 CHESSBOARD 应用于大型异构癌症数据集中的许多其他分析任务，进一步推动多组学数据的相互印证，增加对可变剪接在复杂疾病中所发挥的作用的理解。