空间组织制备的临床挑战

空间转录组学的相关研究是生物医学领域近来的热点所在，是时空分子图像的重要组成部分，也是连接分子信息与临床图像的桥梁。但在空间组织的制备过程中存在诸多挑战，今天小编给介绍一篇由复旦大学附属中山医院临床科学研究所与华大基因研究院等多家机构联合发表在《Clinical and Translational Medicine》,IF=11.492的下面这篇文章。

摘要

目前，时空组学临床应用存在的挑战是对空间转录组的价值和意义、临床组织的制备及其数据分析和指征缺乏足够的理解。该研究利用Stereo-seq技术，系统地测试并分析了临床样本从获取到测序环节中各关键步骤对时空组学数据产出和分析结果的影响。这些关键步骤，包括样本选择、手术方式、样本收集、保存、运输、加工、储存、质控和测序环节等。

研究数据

研究者收集到肺癌组织、正常组织57对共125份样本，包括非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)、肉瘤样癌以及各自混合成分的肿瘤。NSCLC又分为肺腺癌(LUAD)、肺鳞状细胞癌(LUSC)和大细胞癌。在分析研究阶段收集了33对组织共77个样本，验证研究阶段收集了24对组织共48个样本。

研究方法

整个研究从手术室采集样本到转录组印迹流程见图1。包括对不同条件下收集到的样本进行组织学评分、RNA完整性评分和Stereo-seq测序，并对评分结果进行统计分析。

研究成果

1. 样本H&E染色和RIN值评分

研究人员统计了患者的病理特征，包括年龄、性别、癌症家族史、既往癌症史、吸烟史、病理型、T分类、淋巴转移阶段和肿瘤淋巴结转移（TNM）阶段。随后，研究人员将不同病理特征的组织进行H&E和RIN值评分（表1，图2）。将HE分为两组（<90、≥ 90），RIN分为三组（< 6、= 6~7和> 7）。发现这些临床现象与RIN或HE评分没有显著相关性。

2.空间转录组样本制备

该过程是制备高质量样本的关键，研究人员确定了样本制备及储存的多个关键环节和条件：组织类型、取样方式、手术室保存时间、运输条件、样本前处理方式、包埋方式、-80℃下存储天数（图3）。

3. H&E染色评分、RIN值评分与制备步骤的关系

研究者将H&E染色评分、RIN值评分与样本制备过程的数据进行统计分析发现正常组织和肿瘤组织之间的HE评分、RIN评分(图4A,4C)以及癌旁组织和肿瘤组织之间的RIN值评分存在显著差，而癌旁组织和肿瘤组织之间的HE评分(图4B)则没有显著差异。

湿处理组织的H&E评分和RIN值评分水平显著低于干处理组织（图4E、4F）；离体时间超过30 min的组织的H&E评分低于≤30 min的组织的评分，但二者的RIN值评分没有显著差异（图4G、4H）。液氮中干组织和OCT浸润组织的H&E评分和RIN值评分，高于液氮中的湿组织（图4I、4J）。在-80℃下储存>7 d的组织中的H&E评分低于储存≤ 7 d，而RIN评分不存在此现象（图4K、4L）。H&E评分和RIN值评分的相关系数为0.63，具有显著性（图4M）。

综上所述，通过对不同样本的H&E和RIN值评分的统计结果进行分析，可以发现，不同的处理方案之间存在差异。所以，仅通过传统的质控方案，无法精准地对样本进行质量评估，需进一步探索结合所产出空间转录组学数据质控反馈，来明确样本制备的质控标准。

4. Stereo-seq测序结果与样本制备的关系

为了进一步揭示不同变量与Stereo-seq的数据质量之间的关系，研究人员提出了bin 50-UMI/饱和度/测序总读数（BUSSTR）概念。BUSSTR代表RNA捕获效率，依据Bin50捕获量、饱和度和测序结果显示肿瘤样本BUSSTR水平显著高于正常样本（图5B），干样本BUSSTR高于湿样本(图5D)，隔离时间≤30 min的样本BUSSTR高于>30 min的样本(图5E)。气管镜检查和手术方法之间(图5C), - 80◦C≤7d和>7d的保存天数 (图5G)，以及液氮和OCT浸泡干燥组织和湿组织的保存条件之间没有显著性差异(图5F)。RIN和HE评分与UMI这几件无显著性差异(图5 H和I)，RIN < 6、RIN = 6 ~ 7或RIN > 7三组进行差异分析，发现与UMI之间也无显著性差异（图5J）。

5.不同制备步骤的Stereo-seq数据质控结果的比较

研究人员对不同制备条件下的Stereo-seq数据控制结果进行进行了比较（图6）。展示了在Bin50范围内，UMI和空间转录组捕获的基因数量(图6A-D)。HE染色与空间转录组结果duiy2(图E-H)，在bin 50分辨率下用Stereo-seq从两个样本中捕获的UMI数量的空间可视化（图I-L）、不同样本截面的无监督空间约束聚类（图M-P）以及UMAP投影（图Q-T）,发现满足“样本离体小于30 min内处理”和“干燥处理条件”的组织，捕获基因数和UMI数更高，降维聚类效果更好，可以满足后续的分析要求。

总结

临床样本的处理和存储条件，会对时空组学数据质量产生较大影响。在该研究中通过将不同样本处理条件与组织学评分、RIN值评分和Stereo-seq测序结果进行关联分析，明确了影响最终测序质量的手术室保存时间和样本处理这两个关键因素，并给出具体操作建议：样本离体后30 min内尽快进行处理、对样本进行干燥处理。这样临床组织样本制备成功率和时空组学数据的质量都将提高，为时空组学开展基础研究和临床转化医学提供借鉴。