免疫疗法是利用自身的免疫细胞来治疗各种疾病，近年来其在肿瘤治疗领域取得了显著突破，特别是免疫检查点抑制剂的开发，为很多癌症患者带来了生存的希望。然而，由于免疫系统本身在演化过程中擅长的是快速清除入侵机体的外界病原体，而在清除自身细胞来源的肿瘤仍然存在很多缺陷，特别是肿瘤细胞可以进化出多种免疫逃逸的能力。因此，想要完全将肿瘤细胞根除，现存的很多免疫疗法仍然存在很多不足之处。除此之外，免疫检查点抑制剂引发的一系列副反应也是限制很多癌症患者使用其进行长期免疫治疗的主要因素。因此，科学家急需一种可以有效清除肿瘤细胞，同时可以进行良好控制的免疫疗法。在这样的情形下，有研究者率先提出了CAR-T细胞的治疗理念，也正是这种疗法综合考虑了上述两种情况，因此成为了下个阶段肿瘤免疫疗法的一个重要发展方向。

嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptors，简称CARs）是一类具有强大传递信息功能的人工改造受体，它可以重新激活免疫细胞，行使靶向杀伤肿瘤细胞等功能，从而在临床上具有广泛应用。CARs的抗肿瘤效力是由其所设计连接的信号结构域所调控的。目前用于临床的CARs包含一个核心T细胞受体（TCR）信号结构域，这一结构域来源于CD3，包含可以招募ZAP70激酶的免疫受体酪氨酸激活基序（ITAM），以及共刺激信号免疫受体CD28或4-1BB。共刺激结构域自身包含多种信号基序，相应的短链多肽可以通过调节蛋白相互作用结构域（比如Src Homology 2, Src Homology3 等），与特异性下游信号蛋白相结合。这些多肽信号结构域也被称之为线性结构域，是调控绝大部分信号受体的基石之所在。它们通过招募一系列信号蛋白，启动不同的细胞响应。通过改造自身来源的T细胞，可以很好的规避各种排斥反应；同时可以通过多受体的改造理念，实现更精确的杀伤肿瘤细胞。

截至到目前，全球共有8款CAR-T产品获批上市。其中，FDA批准上市的有6款，中国国家药品监督管理局批准上市2款。如今，距最早一款CAR-T产品获批上市已经过去了5年，产品的背后是科研工作者对CAR-T不断的探索以及对其进行改造和完善。特别是近几年CAR-T有一些革命性进展极大的推动了CAR-T细胞的临床应用，下面Immugent就通过几篇高分文献，对CAR-T的发展历程进行综合解读。

1. c-Jun 的过表达可诱导 CAR-T 细胞产生抵抗衰竭

在很长的一段时间内，科学家都是通过干预负调控T细胞的分子来实现增强CAR-T的功能，但是这种方式改造后的T细胞容易产生副作用且很容易走向衰竭，因此后续就有研究开始通过正向调控的分子来改造CAR-T。其中，最早的一项研究就是在2019年发表在Nature上的一篇文章，篇名为：c-Jun overexpression in CAR-T cells induces exhaustion resistance。在这项研究中，作者创新性发现c-Jun的功能缺陷介导耗竭的T细胞功能障碍，而过表达c-Jun的CAR-T细胞显著对抗T细胞衰竭，有效解决了这一新兴治疗方式当前面临的最主要障碍，为CAR-T疗法更广阔的临床应用提供新思路。

图1：

文章参考Long等构建的一个不经抗原刺激即诱导T细胞衰竭的可调节CAR信号模拟系统，即包含14g2a scFv序列和CD28信号结构域的神经节甘脂（GD2）受体（GD2-28z CAR），并在 GD2-28z CAR 质粒的 14g2a scFv 序列制造了一个点位突变以产生新的 CAR 受体（即HA-28z CAR），其对 GD2 表现出更高的亲和性。与 GD2-28z 和不显示可调节信号的 CD19-28z CAR-T 细胞相比，HA-28z CAR-T 细胞刺激后表现出更加明显的衰竭，即出现体外扩增减弱、抑制性受体表达增加、效应分化增强、γ-干扰素（IFNγ）表达降低以及白介素-2（IL-2）表达显著降低等情况。因此，研究人员认为，HA-28z CAR-T 细胞可作为研究人体 T 细胞衰竭的有效模型。通过利用转座酶研究染色质可及性的高通量测序技术，对CD8+ HA-28z CAR-T 细胞和 CD8+ CD19-28z CAR-T 细胞序列进行分析，发现衰竭T细胞基因序列中的开放区域远远高于对照组细胞，而转录激活因子-1(AP-1)基序的可及性也大大增加。同时，衰竭细胞中的碱性亮氨酸拉链（bZIP）和干扰素调节因子（IRF）的 mRNA 水平显著升高，bZIP 家族和 IRF 家族中 JUNB、IRF4、BATF3 蛋白表达显著升高。

图2：

紧接着，作者发现过表达c-Jun并不在表观遗传学水平产生影响，而是显著地改变转录组基因表达，其中，过表达c-Jun显著改变 319 个基因表达，其中包括降低T细胞耗竭基因及增强记忆基因。随后，研究人员实验发现，冗余的AP-1-IRF复合体促进T细胞耗竭进程，而过表达c-Jun可减少或替换染色质中AP- 1复合物对抗该进程。最后，在Nalm6-GD2 +白血病小鼠模型中，研究人员发现JUN-HA-28z CAR-T细胞可增强抗肿瘤作用。同时，体外实验证实，JUN-CD22-BBz CAR-T 细胞显著提升炎症因子的产生，并增强其抗肿瘤活性。总之，这项研究表明过表达c-Jun增强CAR-T细胞靶向实体瘤的能力，为CAR-T在实体瘤的临床治疗中提供了新思路。

2. BATF和IRF4协同抵抗CAR-T细胞走向衰竭

另一项着手通过干预调控T细胞正向功能分子的研究是在2021年发表在Nature Immunology杂志上的一篇文章，篇名为：BATF and IRF4 cooperate to counter exhaustion in tumor-infiltrating CAR T cells。这项研究和上一篇有类似之处，也有不同的地方，类似的是BATF和c-JUN类似，都属于AP-1家族的分子；不同之处是在这项研究中，作者是通过同时干预两个重要分子，从而达到更强大的协同抗肿瘤作用。本文通过小鼠肿瘤模型验证了BATF和IRF4协同对抗T细胞衰竭。结果揭示BATF在CD8+ CAR-T细胞中过表达导致T淋巴细胞的生存和增殖显著增加，增强了CAR-T在刺激后产生细胞因子和颗粒酶的能力，抑制细胞表面受体和耗竭相关转录因子TOX的表达。先前接受BATF转导的CD8+ T细胞并排斥肿瘤的荷瘤小鼠产生了控制肿瘤复发的长期记忆T细胞，控制肿瘤复发。BATF可能通过使CAR-T细胞的表型和转录谱偏离衰竭从而增强效应功能，改善其抗肿瘤反应。操纵CAR-T细胞以更有效的方法来控制肿瘤并对其研究具有非常重要的意义。

图3：

作者首先通过对CD8+T细胞中能够增强NFAT/AP-1活性的转录因子的初步筛选，确定了JUN、MAFF和BATF，并提出了JUN、MAFF或BATF对CD8+ CAR-T细胞具有功能性抗肿瘤优势的假设。作者通过靶向人CD19 (hCD19)的CD8+ CAR-T细胞转导，以及JUN、MAFF、BATF逆转录病毒表达载体或空(pMIG)逆转录病毒做为对照，在肿瘤接种7天后过继转移到携带B16F0-hCD19肿瘤的C57BL/6J小鼠中进行试验。与内源性蛋白相比，转导后各转录因子高表达，但没有改变Myc标记的CAR表达。随后，在小鼠体内过继pMIG或MAFF转导的对照CAR-T细胞后，结果显示肿瘤大小与单独用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的小鼠相似，而小鼠接受JUN转导的CAR-T细胞显示肿瘤生长的不同程度的延迟。为了进一步探索BATF转导的CAR-T细胞的抗肿瘤反应，在肿瘤接种后12天将pMIG-或BATF转导的CAR-T细胞转移到荷瘤受体小鼠体内，并在CAR-T细胞转移后8天收集TILs，与给予对照组pMIG转导的CAR-T细胞的小鼠相比，给予BATF转导的CAR-T细胞的小鼠肿瘤生长明显放缓。经BATF转导的CAR-TILs，通过Thy1.1报告基因的表达鉴定，与pMIG转导的对照组细胞相比，在肿瘤中出现的频率显著增加。

图4：

随后，作者发现Ifnar1及其下游信号效应因子Stat1和Stat3以及Il12rb2的编码基因，在BATF过表达的TILs中与对照TILs相比明显上调。这些差异可能使BATF-过表达的细胞更容易接受干扰素-α/β和白介素-12 (IL- 12)信号，促进效应和效应/内存功能，增加其他效应功能相关基因(Icos和Gzma/b/c)的RNA表达。同时，作者证实这些结果与刺激后ICOS和GZMB蛋白水平的增加一致。此外还观察到编码CCL5、CCR2、CXCR3和CXCR6的mRNA表达水平明显增加，编码CCR7的mRNA表达降低。同样与蛋白水平结果一致的是，经BATF转导的CAR-TILs显示出Tox mRNA的表达量减少，表明在通往衰竭的通路上的一个关键转录环节出现了断裂。总体来说，这项研究中作者证实了CAR-T中过表达BATF促进了可控制肿瘤复发的长寿命记忆T细胞的形成，因此对即时和长期的抗肿瘤反应都有显著的有益作用。

3. cBAF复合体和MYC联合决定CAR-T早期命运

今年发表在Nature杂志上的一项篇名为；cBAF complex components and MYC cooperate early in CD8+ T cell fate的研究，则是发现cBAF复合体成分和MYC在CD8+ T细胞命运的早期中合作关系，这种关系共同决定了CD8 T细胞的功能分化。在这项研究中，作者通过使用基于CRISPR技术，对体内记忆T（Tmem）细胞生成负调控因子进行筛选。最终，研究人员确定了哺乳动物典型BRG1/BRM相关因子（cBAF）的多种成分。cBAF复合物的几个成分对活化的CD8+T细胞分化为T效应（Teff）细胞至关重要，它们的丢失会促进体内Tmem细胞的形成。最终，作者证实了在活化的CD8+T细胞的第一次分裂中，cBAF和MYC经常不对称地共同分配到两个子细胞中。

图5：

为了确定促进记忆T（Tmem）细胞的分子机制，作者首先使用基于CRISPR技术的改良实验，对Tmem细胞生成负调节因子进行筛选。随后通过多步骤的筛选，最终确定了哺乳动物典型BRG1/BRM相关因子（cBAF）的多种成分，并且它们能够明显影响Tmem细胞的形成。在此基础上，作者T淋巴细胞的基础生物学延伸到可能的临床应用，并在此过程中探索深层分子机制。随后，通过实验作者发现，cBAF复合物的几个组分对于活化的CD8+ T细胞分化为T效应(Teff)细胞是必不可少的，它们的缺失促进了体内Tmem细胞的形成。在活化的CD8+ T细胞的第一次分裂过程中，cBAF和MYC经常与两个子细胞不对称地共配。高MYC和高cBAF的子细胞向Teff细胞显示细胞命运轨迹，而低MYC和低cBAF的子细胞优先向Tmem细胞分化。cBAF复合物和MYC物理上相互作用，在活化的CD8+ T细胞中建立染色质景观。在活化的前48小时，即嵌合抗原受体T (CAR-T)细胞生成之前，用假定的cBAF抑制剂处理初代的CD8+ T细胞，可显著提高小鼠实体瘤模型的疗效。

图6：

最后，作者通过小鼠肿瘤模型证实了具有高MYC和高cBAF的子细胞显示出朝向Teff细胞的细胞命运轨迹，而具有低MYC和低cBAF的子细胞则优先向Tmem细胞分化。cBAF复合物和MYC的物理相互作用建立了活化CD8+T细胞的染色质结构。在产生嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞之前，用一种潜在的cBAF抑制剂在激活的头48小时内处理新生的CD8+ T细胞，可明显提高小鼠实体瘤模型的疗效。这些结果确立了cBAF是Tmem细胞命运的负面决定因子，并表明在T细胞分化早期操纵cBAF可以改善癌症免疫疗法。影响CAR-T治疗效果的因素除了输入的T细胞容易走向功能衰竭之外，另一个主要原因就是没有干性（记忆性）。因此，识别促进Tmem细胞的分子调控机制，对疫苗接种和CAR-T免疫治疗中均有重要意义。

4. CD4+ CAR-T具有肿瘤杀伤性且长期存在

传统的CAR-T细胞主要都是集中在能直接杀伤肿瘤的CD8+ T细胞上，上述解读的CAR-T改造也都是针对CD8+ T细胞。下面介绍一篇有关CD4+ CAR-T的研究，相应的文章于今年发表在Nature杂志上，篇名为：Decade-long leukaemia remissions with persistence of CD4+ CAR T cells。这项研究主要是追踪了在2010年接受了CAR-T细胞疗法临床试验的两名白血病患者，作为这项研究的首批参与者，他们的肿瘤细胞在后续治疗后被完全清除。10年后，该研究机构的研究人员通过对这些患者的外周血进行检测发现，CAR-T细胞在患者身体内仍可被检测到。此外，输注的CAR-T细胞随着时间的推移发生了进化，在两名患者身体中都出现了高度激活的CD4+ T细胞群，并且占据主导地位，这些细胞群继续表现出肿瘤细胞杀伤特性。

图7：

首先，作者使用流式细胞仪进行跨时间点检测了CAR-T细胞的占比，同时使用定量PCR证实了两名患者在所有时间点都存在靶点为CD19的CAR-T（CTL019）细胞。此外，对两名患者最近一次血液测试显示，10年后两位患者的血液中仍然可以检测到CTL019细胞，分别占所有T细胞的0.8%和0.1%，而CD19+的B细胞和CLL细胞则一直处于未检测到或高度抑制状态（小于1%）。为了探究CAR-T细胞扩增的克隆性质，研究人员通过分选CAR-T 细胞，对T细胞受体（TCR）β链库进行深度测序（TCR-seq）以及慢病毒载体整合位点（LVIS）分析。TCR-seq揭示了患者1在2.3个月和1.4年时间点之间发生的克隆转变。而患者2的克隆组成在前两年逐渐转变，总体上更加稳定，并且LVIS数据显示基本与TCR-seq数据中观察到的克隆转变一致。

图8：

最后，研究人员通过使用包含40种抗体的质谱流式细胞技术（CyTOF）在多个时间点分析了CAR-T细胞的表型。结果显示，患者1在接受CAR-T细胞治疗后的第1.8个月，CD8+ T细胞占CAR-T细胞的29.3%，并在之后的时间点按比例减少。而CD4+ T细胞在第1.4年占CAR-T 细胞的97.5%，第3.4年到9.3年（最晚时间点）占比甚至超过了99.6%;患者2表现出总体相似的趋势。研究人员进一步研究发现，在两名患者中，CAR-T细胞治疗反应主要分为两个阶段：以CD8+ T细胞和CD4- CD8- Helioshi CAR-T细胞为代表的初始反应阶段，以及以具有增殖性和溶细胞功能的CD4+ CAR-T细胞表型为主的长期缓解期。总之，这项研究系统追踪了两名患者体内CAR-T细胞的长达十年的比例变化、功能和分子特征。这些发现有助于研究人员了解与抗癌反应和白血病长期缓解相关的CD4+ CAR-T细胞特征，为患者疾病长期缓解提供了理论支持。

6.展望

CAR-T细胞疗法已经在血液系统恶性肿瘤中取得了巨大成功，但目前尚未在实体瘤中取得成果,这主要是由于血液瘤与实体瘤之间存在着明显的差异。例如，在实体瘤中存在较少的靶抗原。此外，许多实体瘤是“冷”肿瘤，免疫细胞对TME的浸润性很差。由于免疫抑制的TME，即使有大量免疫细胞浸润到肿瘤中，免疫细胞也不能很好的发挥作用。因此，通过改造CAR-T细胞，使其更适用于治疗实体瘤是未来CAR-T细胞的主要发展方向。在实体瘤中一个主要面临的难题就是肿瘤浸润的T细胞很快走向衰竭而失去杀伤功能，从上述几项研究也可以看出，无论是基于过表达 c-Jun、cBAF复合体，还是 BATF和IRF4配伍的CAR-T 细胞均显示较好的对抗T细胞衰竭的特点。此外，不同于传统的基于杀伤性的CD8 T细胞，CD4 T细胞也具有很好的发展潜力，CD4 T细胞不容易走向衰竭和良好的记忆性会是下一个CAR-T细胞的重要发展方向。特别是最新的一些研究发现CD4 T细胞也有一群杀伤性T细胞亚群（CD4-CTL），可以通过MHC-II分子直接杀伤肿瘤。

事实上，目前基于CAR的改造细胞理念已经不在局限于T细胞了。除了CAR-T细胞，还可以改造其它免疫细胞，如：CAR-NK, CAR-Macrophages等。与CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞有几个优势，包括免疫细胞来源丰富，没有GvHD等优势。然而与CAR-T细胞治疗相关的大多数障碍也适用于CAR-NK细胞。由于CAR-T和CAR-NK细胞治疗的这些障碍，最近 CAR-Macrophages已成为一种替代疗法。虽然 CAR-Macrophages与CAR-T细胞有许多共同的特征和障碍，如对特异性抗原的需求、抗原逃逸和下调以及全身性细胞因子毒性等。然而，与CAR-T细胞相比，CAR-Macrophages在实体肿瘤治疗两个主要障碍上具有独特的优势：免疫细胞向TME的迁移和浸润，以及逆转免疫抑制性TME。每一种免疫细胞具有其特殊的功能，因此，在未来很有可能会将不同CAR免疫细胞进行混合，通过发挥它们各自的优势来达到一个更加理想的协同抗肿瘤效果，让我们拭目以待！

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