今天给大家分享一篇发表在Cancer Cell(IF:38.585)上的文章:
Spatially resolved multi-omics deciphers bidirectional tumor-host interdependence in glioblastoma
空间多组学解析胶质母细胞瘤中肿瘤-宿主的相互依赖性
一.研究背景
高级别和低级别胶质瘤的单细胞RNA测序(scRNA-seq)研究表明,肿瘤内异质性和细胞状态的动态可塑性是恶性脑肿瘤的标志。这种动态适应发生在四种不同的状态中,即间充质样(MES样)、神经祖细胞样(NPC样)、星形胶质细胞样(AC样)和少突胶质前体细胞样(OPC样)状态。尽管脑肿瘤呈现出与健康大脑相似的转录适应和进化,但它们长期以来一直作为一个独立实体进行研究,忽略了局部微环境在肿瘤发生中的作用。然而,最近的文献报道肿瘤细胞与神经元环境的局部相互作用,其中神经元、神经胶质细胞和免疫细胞对复杂且动态异质的神经胶质瘤网络有贡献。由于空间组织信息的丢失,单细胞分析仅提供细胞相互作用的间接推断。在大脑中,空间组织和功能密切相关。因此,研究者假设中枢神经系统恶性肿瘤在功能和空间上也是有组织的。空间转录组学(stRNA-seq)是一项新技术,它允许在原位表征细胞相互作用和组织,从而破译恶性脑肿瘤的生态系统。鉴于scRNA-seq和stRNA-seq具有互补性,两种技术的整合至关重要。细胞通讯和代谢是对脑癌动态适应具有决定性影响的两个关键因素,促进生长、浸润和治疗耐药。这些代谢改变可归因于肿瘤代谢的微环境或区域异质性。例如,已经证明,缺氧导致的强制代谢恶化显著驱动转录适应和基因组不稳定性。肿瘤细胞与免疫系统之间的细胞相互作用也越来越受到关注,最近的一项研究证明,表观遗传免疫编辑驱动获得性免疫入侵程序,导致胶质母细胞瘤中出现的空间异质性景观。这些研究进一步强调,需要在空间分辨的背景下,全面研究胶质瘤由于微环境而产生的各种转录适应性。该研究旨在提供胶质母细胞瘤与其局部微环境的空间分辨转录程序和细胞相互作用图谱。
二.研究方法
研究者通过空间分辨的转录组学、代谢组学和蛋白质组学来表征胶质母细胞瘤,确定以免疫和代谢应激因素为标志的微环境,揭示了局部区域肿瘤-宿主的相互依赖性,从而导致空间特定适应性转录程序的产生。此外,他们将胶质母细胞瘤干细胞模型植入人类和啮齿动物新皮质组织模拟各种环境,证实了转录状态源于对各种环境的动态适应。
三.研究结果
1、胶质母细胞瘤(GBM)的空间分辨转录组图谱
为了表征GBM的空间结构,研究者产生了28个样本的空间转录组学(stRNA-seq)图谱,共产生了88,793个spots。研究者还补充了来自组织的空间代谢组学和蛋白质组学(用于stRNA-seq辅助整合分析(图1A)。基于相互最近邻(MNN)的水平整合和共享最近邻(SNN)聚类显示,非恶性样本在患者之间表现出相似性。恶性样本以独特的基因表达谱为特征,聚类间样本多样性的高香农熵进一步证实了这一点(图1B)。若恶性起源的样本显示出显著较低的熵,则表明该簇由个体患者的spots组成(图1B和1C)。这些发现与最近的单细胞研究一致,即大量个体拷贝数改变和突变谱有助于患者间的异质性,从而导致个体转录谱改变。在所有样本的88,793个spots中,63,121个spots来自恶性样本,其中46,459个spots,每个spot中肿瘤细胞含量的比例在95%以上(图1C)。为了研究肿瘤浸润区域,作者根据Ivy GAP组织学分类系统预测了spots组织学表型(图1D)。与组织病理学特征相比,具有低肿瘤细胞频率的样本主要包含浸润区域,在这些区域中,健康皮质内很少有肿瘤细胞的存在(图1E)。
2.解析空间分辨率的转录异质性
研究者通过与现有的转录和组织学分类数据联系来重现空间转录模式。通过空间转录组学的分析,发现了五个转录模式,并且90%的肿瘤中存在这5个模式(图2A)。随后研究者整合了患者空间加权相关矩阵,然后是层次聚类,证实了五个空间不同转录模式在空间中是分离的(图2A)。通过探索这些不同的程序,研究者确定了两个与胶质相关基因(如GFAP、AQP4、VIM、CD44)高表达相关的空间不同的转录模式。虽然这两个模式都显示了神经胶质谱系,但其中一个与放射状神经胶质相关基因(如HOPX、PTPRZ1)表达增加相关,称为“Radial Glia”;另一个显示了炎症相关基因(如HLA-DRA、C3)和INF-γ通路的功能富集,称为“Reactive Immune”(图2A)。其余的转录模式显示出与神经胶质谱系一致,并根据其神经称为“Neuronal Development”或者少突胶质细胞起源以“Spatial OPC”命名(图2C)。第五个转录模式,进一步称为“Reactive Hypoxia”,该模式与缺氧反应(如VEGFR、HMOX1、GAPDH)和糖酵解(如LDHA、PGK1)基因相关,表明与低浓度氧结合的代谢改变在某些区域驱动转录上不同的状态(图2A、2B)。
3.不同的空间转录模式独立于细胞周期
为了确定检测到的不同的空间转录模式是否存在于所有细胞周期阶段,研究者根据其转录和细胞周期程序对所有spots进行分类。转录模式均匀分布在所有细胞周期阶段(图2A)。为了进一步将发现与现有分类系统相结合,对已有的bulkRNA-seq、scRNA-seq和stRNA-seq上不同的转录模式分类进行了空间加权回归,以映射空间关系(图2C)。利用Neftel等人的scRNAseq数据集对不同空间转录模式得分最高的基因特征进行整合,证实Radial Glia、Spatial OPC和Neuronal Development三个转录模式分别与AC-like、OPC-like和NPC-like具有很大的重叠。与Richards等人的数据相比,上述所有模式均与神经发育表型具有大部分重叠(图2C)。Reactive Hypoxia模式与MES-like亚型具有很大部分重叠,特别是缺氧依赖性“MES2”状态(图2C)。
4.不同的空间转录模式和亚克隆结构
拷贝数改变(CNA),包括癌基因的局灶性扩增或肿瘤抑制因子的丢失,是恶性细胞的标志,据报道,这些细胞会导致治疗耐药和肿瘤复发。在已知的细胞状态分类中,独特的CNA与特定状态相关联,但在单个肿瘤细胞中分布不均匀。在Reactive Hypoxia相关spots中,研究者发现CNA的显著累积作为独立的亚克隆事件发生(图2D)。接下来,作者研究空间上不同的转录多样性是否可以直接反映肿瘤内亚克隆。他们通过患者特异性的CNA进行层次聚类重建克隆结构。共鉴定出57个亚克隆,每个样本含有2至6个亚克隆不等(图3A)。然后,确定了每个亚克隆中样本、不同的空间转录模式的分布(图3B和3C)。分析表明,在26.32%的亚克隆中,单一转录模式占主导地位(每个亚克隆的spots数超过75%)。这些结果表明克隆结构对不同空间转录模式的发生影响不大,尽管亚克隆偶尔偏向Spatial OPC(8.77%)或Reactive Hypoxia模式(10.52%)(图3D)。
5.与Reactive Hypoxia模式相关的代谢改变
为了进一步探索空间上不同的Reactive Hypoxia模式,研究者进行空间代谢组学研究(图4A)。进一步分析识别出三个显著的代谢亚组(图4A、4B)。功能代谢分析显示第一个代谢模块(M-G1)中磷酸戊糖途径显著富集。第二个代谢模块(M-G2)的特征是磷酸腺苷酸代谢的富集。第三个代谢模块(M-G3)在糖酵解和氨基糖代谢显著富集(图4C)。
6.Reactive Hypoxia模式积累染色体改变
由于缺氧已被证明会导致DNA损伤应答和修复基因的表达改变,从而抑制重组介导的DNA双链断裂修复,增加突变率和CNA。为了研究假设,探索了Reactive Hypoxia通路富集的区域,该区域还富集糖酵解途径(图4D)。并且CNA图谱显示,在缺氧核心区,染色体15p、14q和7p/q显著缺失。个别样本在多条染色体(8p、9p、13q、19q和21q)上也显示出的丢失和扩增,这种变异最有可能由缺氧核心区域内的单个亚克隆造成,这证明了缺氧相关代谢是一种潜在的基因组不稳定性的驱动因素(图4E)。
为了进一步验证该发现,研究者分析了TCGA-GBM样本(GBM IDH1/2野生型n=357),根据患者的缺氧基因表达评分对其进行分类(图5A和5B)。缺氧驱动的肿瘤显示染色体改变显著增加,证实了代谢与基因组不稳定性之间的关系(图5C和5D)。进一步实验验证,在常氧和缺氧条件下培养了原代患者来源的GBM细胞系2-6周(图5E)。在慢性缺氧条件下CNA事件的显著累积证实了应激诱导CNA变异的假设(图4E)。此外,研究者通过分析常氧和缺氧条件下CpG位点cg12434587和cg12981137处的O-6甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)启动子甲基化,研究了缺氧代谢对DNA甲基化的影响。在常氧条件下具有非甲基化MGMT启动子的细胞系在缺氧条件下会发生高甲基化(图5F)。
7.缺氧代谢调节GBM中的“go or grow”潜能
有文献报道表明缺氧应激触发细胞周期停滞,特别是S期停滞(图6A)。根据研究模型,观察到了缺氧代谢和细胞迁移之间的反向关系(图6B、6C和6D)。总之,他们的发现为代谢变化和氧化应激是基因组多样性的潜在相互驱动因素提供了证据,从而导致GBM的克隆进化。
当缺氧发生时,这种低氧诱导的糖酵解转变会导致go programs的诱导,这有助于细胞逃逸/迁移到常氧区。由于在缺氧条件下,会发生S期停滞,随后会导致从头CNA的积累。作者假设这些受缺氧影响的细胞中有很大一部分会进入凋亡状态,导致在GBM中看到的特征性坏死。只有一小部分细胞通过迁移相关转录模式的上调成功逃脱。除缺氧外,据报道,其他压力源(如放射或化疗)会导致GBM出现这种与压力相关的扰动(图6A)。
根据这个模型,可以看到低氧代谢和细胞迁移之间的反比关系。为了探索代谢改变区域中迁移基因表达特征的富集,研究者确定了特定基因表达特征的低富集和高富集之间的定向梯度的空间方向。每个点的方向向量是基于其局部邻域中所研究的基因表达特征的分级富集。这些向量场计算使作者能够近似空间基因表达轨迹,从而能够识别空间上相反的转录途径(图6B)。基于这些矢量场计算,研究者报告缺氧响应和迁移特征显示反向空间轨迹(图6C和6D)。
8.探索Reactive Immune区域的肿瘤-宿主相互依赖性
研究者空间蛋白质组学分析发现,在Reactive Immune的区域中,髓系细胞和淋巴细胞显著增加(图7A、7B和7C)。为了研究Reactive Immune区域的肿瘤细胞分化,研究者通过将细胞细分为Radial Glia(EGFR+HOPX+)、Reactive Immune(EGFR+CHI3L1+VIM+)、Spatial OPC(EGFR+OLIG1+)、Neuronal Development(EGFR+SNAP25+CALM2+)和Reactive Hypoxia(EGFR+)。
研究者根据肿瘤细胞与淋巴或髓系细胞之间的距离量化了它们之间的细胞连通性,证实了肿瘤细胞与转录定义的Reactive Immune区域中的免疫区室之间增强的细胞相互作用(图7D)。接下来,探讨了不同(regions of interest)ROI中细胞类型的分布。研究者证实了在Reactive Immune和Reactive Hypoxia中有AC-like和MES-like细胞富集。OPC-like细胞主要富集于Neuronal Development中(图7E和7F)。此外,Reactive Immune和Reactive Hypoxia区域均显示肿瘤相关髓系细胞(TAM)和T细胞显著富集(图7G)。
鉴于T细胞在Reactive Immune和Reactive Hypoxia区域都富集,作者研究了T细胞(CD3+)上的平均PD-1蛋白水平,与Reactive Hypoxia和Neuronal Development相比,Reactive Immune区域内显著增加,表明Reactive Immune中的局部免疫抑制增强。此外,GBM的scRNA-seq数据集证实了肿瘤Reactive Immune区域中记忆和耗竭T细胞的富集(图7H)。
9.环境条件有助于双向亚型转变
通过之前建立的基于人体器官型新皮质组织的GBM模型来模拟了组织浸润,该模型没有代谢和免疫压力。为了评估各种微环境的影响,研究者使用了不同年龄的人类组织和来自2周小鼠和2岁大鼠的组织(图8A)。将组织培养4天,然后将类似MES-like原发性患者衍生细胞系接种到所有培养的组织切片中(图8A)。培养7天后,消化组织,并使用FACS分离肿瘤细胞,进行scRNA-seq分析。使用inferred CNAs分析(图8C和8D),基于肿瘤细胞在7号染色体中的特征性扩增对肿瘤细胞进行计算鉴定。
为了探索不同宿主环境的动态适应,所有恶性细胞都根据其相应细胞状态进行富集(图8E和8F)。基线状态显示出MES-1/2-like的表型,转录多样性程度低但大多数处于细胞周期循环(图8E)。在啮齿动物神经环境中培养的GBM细胞表现出MES-1/2-like和AC-like转录特征的富集。为了探索动态适应,作者进行了RNA速率分析(图8G)。
一般来说,从初始体外细胞培养(图8G和8H)到MES-like和AC-like,表示由神经环境驱动的方向自适应。PTPRZ1是放射状胶质细胞分化的GBM细胞的常见标记基因,基于其在MES-AC-hybrid状态下的高速率相图(图8G、8H和8I),研究者的分析证实了OPC-like和NPC-like分支内的双向命运。
四、总结
综上所述,该工作在胶质母细胞瘤样本中使用空间分辨多组学,并识别以免疫和代谢应激因子为特征的微环境。这些空间生态位受肿瘤微环境的影响,反映了对炎症或代谢刺激的转录适应,并重现了神经发育阶段。这篇文章有很多值得我们学习的地方,比如在实验技术上,采用了许多先进的空间组学技术,空间转录组、空间代谢组以及空间蛋白质组;在机制上,联合了体内和体外模型,逐步验证潜在的机制。