预测免疫检查点阻断分类器识别对抑制PD-1和/或CTLA-4有反应的肿瘤

我们首先看这篇发布的期刊。这片文章发布在期刊: Clinical Cancer Research，这个期刊2021影响因子: 12.531。比去年上升了2.424。中科院大类: 医学 1区，中科院小类: 1区 肿瘤学。

目的：

联合应用抗-PD-1和抗-CTLA-4免疫检查点阻断（ICB）可改善患者的病情，但会发生严重的免疫相关的不良事件和承担极高的成本。因此，迫切需要预测哪些患者对单一疗法有反应，哪些患者需要联合ICB 治疗。

发现问题：

虽然目前可用的标记可以预测一般的ICB反应，但它们无法区分抗-CTLA-4或抗-PD-1在联合作用下的反应，此外，这些分类器缺乏区分肿瘤细胞固有和肿瘤细胞外部(肿瘤微环境(TME)与基质)信号的能力。

背景知识：

在患者来源的异种移植黑色素瘤(PDX)中，人肿瘤微环境(TME)细胞迅速被小鼠细胞移植取代。作者使用XenofilteR deconvolution算法筛选了人类肿瘤细胞的RNA reads，随后用计算机从大量(肿瘤细胞+ TME)患者的黑色素瘤RNA中减去它们。这产生了一个纯肿瘤细胞固有特征(“InTumor”)和一个由肿瘤细胞外RNA序列(“ExTumor”)组成的特征。

提出假设：作者假设预测信号的框架应该包含独立的肿瘤细胞固有和外在元素。

结果：

• 肿瘤细胞和TME的RNA信号可以被计算机分解

抗-CTLA-4或抗-PD-1治疗对肿瘤和TME有不同的影响，因此作者认为，在构建基因表达标记来预测临床反应时，应该考虑这两种影响。计算机分析将来自患者(来自TCGA)的肿瘤和TME基因和来自PDX的基因的黑色素瘤RNA表达做比较，表明小鼠TME几乎完全取代了人类TME在PDX生长后的第一个传代(Fig. 1a)。基于基因表达的TME deconvolution工具和物种特异性抗体免疫组化染色证实了这一点(Fig. 1b-d)。

通过去除小鼠来源的序列，作者获得了人特异性肿瘤细胞固有基因表达值。这些经过筛选的信号使作者能够从患者的大量肿瘤(即肿瘤细胞+TME)基因表达信号中计算出肿瘤细胞内部的基因表达信号，从而建立TME基因表达特征(Fig. 2a)。这产生了一组767个在患者的大量黑色素瘤中表达的基因，这些基因(几乎)是PDX所缺乏的(Fig. 2b)单细胞测序(scSeq)数据证实这些基因主要在非肿瘤细胞如T、B、NK和内皮细胞中表达(Fig. 2c)，这些数据表明，将xenfilter算法应用于PDX数据，可以计算分析肿瘤细胞和TME的RNA信号。

Figure 1. Human TME cells are replaced by mouse cells upon PDX grafting.

Figure 2. Computational dissection of tumor and TME signals from human Melanomas reveals an immune infiltration signature predicting response to anti-CTLA-4 monotherapy.

• TME信号可以概括TCGA黑色素瘤的分类

在TCGA中，患者黑色素瘤根据三个遗传特征(“MITF-low”、“角蛋白”和“免疫”)进行分类。为了确定TME基因符合分类，作者仅使用这些TME和免疫相关基因对TCGA黑色素瘤样本进行了聚类分析。结果显示了与三种黑色素瘤亚群的高度重叠，这三种黑色素瘤的亚群以往便是作为大量肿瘤信号(Fig. 2d)。因此，通过计算从大量肿瘤信号中减去肿瘤细胞固有的基因表达信号，作者发现了数百个TME特异性基因信号，这些信号足以在两个独立的肿瘤数据集中概括黑色素瘤亚群的分类。这些结果说明了TME信号的重要性，表明TCGA对黑素瘤的分类在很大程度上是基于TME中肿瘤信号的基因表达信号，而不是肿瘤细胞固有信号。

• 肿瘤细胞外特征预测对抗-CTLA-4治疗的反应

本研究的主要目的是对联合ICB治疗生成预测分类器。以前，有人证明ICB应答同时受到肿瘤细胞固有因子和TME因子的影响，并且认为一个预测分类器应该包含这两个不同的特征。在对TME基因行检测时，作者发现将近一半的基因表现出高度的共调控，且与免疫相关。这一半的基因的表达与多种免疫细胞类型高度相关，包括T细胞(R=0.9)和B细胞(R=0.7) (Fig. 2e)。利用这些免疫相关基因，作者建立了 “外肿瘤特征”，并确定其是否能够预测ICB治疗的黑色素瘤患者的临床结局，无论是抗-CTLA-4或抗-PD-1。作者用基因集富集分析(GSEA)分析在抗-PD-1单药治疗开始前队列患者样本的基因表达数据。Ex-Tumor标记未能显示与该患者队列的临床结局相关。相比之下，在接受抗-CTLA-4单药治疗前的肿瘤试验中，作者观察到Ex-Tumor特征基因的高表达与临床反应之间的显著相关性(FDR <0.02, Fig. 2f-g)。在开始抗-CTLA-4治疗前的一个独立队列患者样本中验证了这种相关性(Fig. 2h)，ExTumor特征再次与临床结果相关，在有临床疗效的病人中有更高的表达并且ExTumor特征最高表达(最高四分位数)的患者总生存率更高(LogRank p = 0.028, Fig. 2i) 因此，ExTumor特征与抗-CTLA-4反应密切相关，而与抗-PD-1治疗无关。

• 肿瘤细胞的固有特征预测抗-PD-1治疗的反应

考虑到ExTumor标记无法预测对抗-PD-1治疗的反应，作者研究了这种反应是否可以被肿瘤细胞固有因子预测，作者再次使用PDX信号(Fig.3a)并对肿瘤细胞固有RNA表达数据的主成分分析(PCA)，在PDX集合中，一个主成分与免疫相关信号通路(TGFb, IL2/STAT5和IFNg，)相关，并在治疗开始前的患者样本中显示与抗pd -1应答相关(FDR = 0.097, Fig.3b) 来自这集合的基因被用来建立一个 “InTumor”基因表达标签。它们富集了编码细胞膜蛋白的基因，包括涉及“细胞-细胞信号”(NRP1, IL1B)、“炎症反应”(NGFR, CCR1)和“信号转导”(ITPKA)的基因。作者证实了InTumor标记对肿瘤细胞(而不是TME)基因是特异性的，表现为:(i)其在PDX和匹配的PDX细胞株之间的高度一致性。(ii)采用品种特异性抗体进行免疫组化。以及(iii)在使用TCGA数据库时， InTumor特征表达与免疫细胞之间缺乏显著相关性，接下来，作者确定了InTumor特征是否预测抗-PD-1的反应。为了排除非肿瘤细胞(在许多患者肿瘤序列数据中大量存在)的任何影响，作者首先将这一特征的基因数量减少到14个，与TME相比，在肿瘤中至少高出10倍的表达，然后，作者对抗-PD-1单药治疗前获得的队列患者样本的基因表达数据进行GSEA，该分析显示InTumor组中有大量无反应患者(Chi-square p < 0.05;Fig.3c) 而且，InTumor中预测的性能优于之前的三个（Fig. 3d。 在这个数据集中，只有EMT标签优于InTumor。根据中值表达将患者样本分成两组，InTumor^LO组患者的应答率为75%，InTumor^HI患者的应答率为40%(Fig. 3e) 。在与TMB和ICB反应之间的关联保持一致，这些预测意义重大，但并不严谨。这可以部分解释为错误分类的预测应答者显示明显较低的TMB(Fig. 3f)。在第二组接受抗-PD-1单药治疗的皮肤黑色素瘤患者中也出现了相同的结果，证明了在治疗开始前和治疗中患者样本中InTumor信号的预测能力。对于两组治疗前数据集，InTumor^HI组和InTumor^LO组之间没有观察到肿瘤突变负荷(TMB)的差异，未观察到InTumor标记与抗-CTLA-4反应之间的联系。因此，InTumor特征与抗-PD-1反应呈强烈的负相关关系，而与抗-CTLA-4无关。为了生物学上验证InTumor特征和免疫敏感性之间的负相关关系。作者在最近建立的明确的活体环境中验证这个特征是否预示了T细胞的死亡。作者从同一患者衍生出的中黑色素瘤PDX选择了两例，分别显示低和高InTumor特征(Fig. 3g) 这些PDX被移植到小鼠体内，随后用与TCR匹配的细胞毒性T细胞和过继T细胞转移(ACT)进行治疗，这种设置允许作者在相同的TME和免疫浸润条件下治疗这些InTumor^HI组和InTumor^LO组。作者观察到在InTumor^LOPDX中可完全控制T细胞介导的肿瘤(M009;Fig. 3h) 相比之下，InTumor^HI组PDX (M009R)的扩张呈指数级，与对照过继T细胞转移(ACT)难以区分(Fig. 3i) 。这些结果在四种不同InTumor评分的黑色素瘤细胞系中得到了证实。作者未观察到反应与T细胞浸润相关性。这些结果证实了InTumor^HI信号与体内抗T细胞杀伤有关。

Figure 3. A tumor cell-intrinsic gene expression signature predicts invivo

response to T cell killing and to anti-PD-1.

• InTumor和ExTumor信号共同预测抗-CTLA-4或抗-PD-1联合治疗的反应

预测抗-CTLA-4反应的ExTumor特征和预测抗-PD-1反应的InTumor特征的建立，使作者可以进一步研究这些特征是否单独对联合治疗中抗-CTLA-4或抗-PD-1的临床反应具有预测价值。由于ExTumor和InTumor信号单独预测会低估了对联合ICB有反应的人数，所以作者接下来确定了它们在一起使用时是否对联合ICB有更好的预测能力(chi-square p=0.003, AUC = 0.92, Fig. 4a) 。在无进展期(PFS)案例中，联合特征预测显示对ICB联合治疗有效者和无效者存在显著差异(logrank, p=0.0001, Fig. 4b)。最后，作者将InTumor和ExTumor特征结合起来，将它们划分为应答象限，来确定对单药治疗(抗-CTLA-4或抗-PD-1)和联合ICB治疗(抗-PD-1+抗和抗-CTLA-4)应答的百分比(5 cohorts, n=131 patients, Fig. 4C) 无论是抗PD -1单药治疗还是联合治疗，这些队列中患者的象限分类与临床获益显著相关(Chi-square, p < 0.001 and p < 0.05, resp. Fig. 4c) 。更重要的是，该分析显示，使用InTumor^HI/ ExTumor分类的的患者对肿瘤的反应明显更好。联合(抗-CTLA-4+和抗PD-1)治疗(80%的患者有临床获益)比单独抗-CTLA-4或抗-PD-1治疗有效（36% and 33% resp.,Chi-square p < 0.05, Fig. 4d）。此外，InTumor^LO/ ExTumor^Lo组除了抗PD-1外，抗-CTLA-4也没有显著获益(Chi-square p < 0.05, Fig. 4d)表明该ICB反应象限模型有潜力进行个性化反应预测，从而指导治疗选择。

Figure 4. Joint InTumor and ExTumor signatures predict response to ICB combination therapy.

全文小结：

作者使用自己开发的算法对来自小鼠和人类的基因表达信号进行筛选，这种方法获得了肿瘤细胞来源的“InTumor”和肿瘤细胞外部的“ExTumor”基因表达谱。生物学上，作者证明，在小鼠中，具有高InTumor标记评分的黑色素瘤很难消除T细胞。InTumor标记预测抗-PD-1反应，而ExTumor预测抗-CTLA-4获益。在PDX, InTumorLO，而不是InTumorHI中，细胞毒性T细胞有效地清除肿瘤细胞。当联合使用时，InTumor和ExTumor标签不仅识别出联合治疗比单药治疗有明显更高的治疗机会的患者，而且还识别出那些可能从抗-CTLA-4和抗-PD-1中获益甚微的患者。