提起炎症，除了“红、肿、热、痛”外，还得留意一个关键词-“溶解”。在炎症反应中，中性粒细胞死亡后释放各种蛋白水解酶溶解坏死组织。今天就带大家一起看一篇以溶解为主题的生信分析。文章“ Gene Expression of the D-Series Resolvin Pathway Predicts Activation of Anti-Tumor Immunity and Clinical Outcomes in Head and Neck Cancer ”于2022年6月发表于《International Journal of Molecular Sciences》,影响因子5.98分。

研究背景

1、病原体、肿瘤等因素引起的炎症，均在局部呈现出复杂的免疫微环境，从炎症出现到炎症吸收，是一个活跃的过程，包括细胞浸润成分的改变，如从多态核中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophils, PMN)到单核-巨噬细胞。重庆大学附属肿瘤医院李咏生、吴永忠团队在《Signal Transduction and Targeted Therapy》杂志发表了题为“Inflammation and tumor progression: signaling pathways and targeted intervention”的长篇综述论文，从炎症的启动与消退过程入手，系统阐述了炎症与肿瘤发生、发展及治疗之间的复杂关系，深入解析了促癌和抑癌的炎症类型，并详细讨论了靶向调控炎症在肿瘤治疗中的干预策略。

2、炎症的消退不是被动的炎症反应的终止，而是在炎症发生后最初数小时内即启动的，由多种细胞和抗炎因子、促消退介质（Specialized Proresolving Mediators, SPM）共同参与的主动的程序化过程。一旦炎症无法及时消退，则转变为慢性炎症，可能会诱发包括恶性肿瘤在内的一系列炎症疾病。

3、SPM属包含四个主要的生物活性化合物超家族，分别是脂氧素类(lipoxins,LX)、resolvins (resolvins , Rv)、marisins (Mar), 外源凝集素和保护素(protectins, PD)。二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)通过15-脂氧合酶(LOX)介导的碳-17氧化反应生成RvD。RvD调节白细胞浸润和活性，以及细胞因子的释放以促进炎症的缓解。RvD超家族包括6个成员(RvD 1-6)。

结果展示

Definition of the RvD Score and Patients Stratification

RvD评分的定义和患者分层

为了评估RvD评分和临床结果之间的关系，作者从提取了TCGA的头颈部肿瘤 (HNSC) 的RNA-seq数据，用于计算RvD评分。最终的RvD评分计算结果如图1B所示。作者将HNSC的RNA-seq数据与患者的临床特征进行整合，并根据RvD评分将HNSC患者进行分层（高评分VS低评分）。这些亚组被用于分析RvD评分在预测预后，以及差异表达基因参与的生物学过程，预测患者对免疫治疗的反应、与肿瘤内免疫细胞浸润水平 (图1C)。此外，对人乳头瘤病毒(HPV)阴性的HNSC也进行了的分析。既往文献报道HPV阴性HNSC的预后通常比HPV阳性的HNSC差。

High RvD Score Predicts Better Prognosis in HNSC

高RvD评分预示HNSC预后较好

RvD通路包括了5个基因: ALOX15、ALOX15、FPR2、GPR18、GPR32、HPGD和PTGR1。利用TCGA-HNSC的RNA-seq数据分绘制成5个基因的的热图(图2A)。为了评估RvD通路中基因表达水平与患者生存时间之间的关系，在TIMER 2.0数据库进行纳入年龄、性别和肿瘤纯度的Cox比例风险模型分析(图2B)。结果显示，GPR18基因的表达水平与HPV阳性和HNSC患者更好的预后显著相关，因此提示信号传导相关基因高表达具有保护作用。值得注意的是，GPR18的表达也与宫颈癌(CESC) (另一种HPV 阳性肿瘤) 以及几种恶性肿瘤(如尿路上皮性膀胱癌、间皮瘤、皮肤黑色素瘤)的预后成正相关，进一步证实了其对肿瘤的保护作用。而另一种RvD受体，GPR32的表达水平与其它几种肿瘤预后较差相关，如肾嫌色细胞癌、颈肾肾乳头状细胞癌和低级别胶质瘤。其他RvD通路中的基因在不同肿瘤中与预后的关系也不一致。相反，PTGR1的表达与肿瘤患者死亡风险的增加相关，尤其是在HPV 阴性的HNSC中，而PTGR1在肾肾透明细胞癌中具有保护作用。因此，参与RvD通路的基因在不同肿瘤中对肿瘤进展有不同的作用，从而揭示了RvD通路在肿瘤发生过程中的重要性。

作者接下来根据RvD评分(图1B)对HNSC患者进行分层，并分析其临床结局。与RvD评分较低的患者相比，RvD评分较高的患者无病生存期显著增加(图2C)，这表明RvD评分较高的HNSC患者具有明显的生存优势。与此一致的是，与死亡的患者相比，生存及或非肿瘤原因死亡患者的RvD评分较高(图2D)，进一步证实了RvD评分与HNSC临床结局相关。相比之下，采用(ALOX5 + ALOX12) (ALOX15 + ALOX5) (FPR2 + GPR32)/(HPGD + PTGR1)计算的脂氧素评分(lipoxin评分), 应用与RvD评分相同的原则，lipoxin评分不能预测HNSC的生存 (图2E)。总的来说，RvD评分与HNSC的较好预后相关。

HNSC with High RvD Score Showed Transcriptional Fingerprints of Enhanced Anti-Tumor Immunity

高RvD评分的HNSC具有增强抗肿瘤免疫的转录图谱

为了研究RvD评分较高的肿瘤的转录情况，作者在单基因水平上比较了RvD评分高和RvD评分低的患者的RNA-seq数据，分析差异表达的基因。一共包括254个下调和2304个上调的差异基因(图3A,B)。此外，智能途径分析(Ingenuity Pathway Analysis, IPA) 软件显示，RvD评分高组中，差异基因与抗肿瘤免疫相关的条目相关，如Th1通路、白细胞活化和细胞毒性，白细胞介素-1 β (IL1B)、肿瘤坏死因子α (TNF)和干扰素γ (INFG)的活化驱动(图3C)。通过数据库(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, DAVID) 进行基因本体(GO)分析，证实RvD评分高组中的差异基因在炎症、免疫应答、细胞因子和趋化因子信号传导、先天免疫和适应性免疫、T细胞激活等方面发挥作用。因此，具有较高RvD评分肿瘤显示出有益的抗肿瘤免疫的趋势。

为了证实这一发现，IPA被用于分析RvD评分高的肿瘤中受到影响的基因 (图1C)。在分子和细胞水平上，高RvD评分肿瘤中的差异基因与细胞间信号和相互作用以及细胞运动和信号的调节显著相关。差异基因参与调节血细胞的发育和活动、免疫细胞运输和免疫反应(图4A)。受影响最显著的生物过程有白细胞亚群的细胞移动(图4B)和激活(图4C)。为了推断肿瘤内浸润的白细胞水平，利用CIBERSORT分析了高与低RvD评分的肿瘤的整体RNA-seq数据(图1C)，分析 10个白细胞亚群的丰度(B细胞、浆细胞、CD8 +和CD4 +、T细胞、NK细胞、单核/巨噬细胞、树突状细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞)。RvD评分高的肿瘤CD4 +、CD8 + T淋巴细胞等抗肿瘤效应物水平升高(图4D)，血浆和树突状细胞浸润减少。此外，差异基因的IPA显示高RvD评分的肿瘤显示骨髓细胞和淋巴细胞的激活增加(图4E)，免疫炎症介质水平增加，细胞介导、细胞毒性和体液反应增强(图4F)。总的来说，对差异基因分析表明，RvD评分识别出了具有改变的免疫效应动力学和抗肿瘤激活状态的HNSC肿瘤。

High RvD Score Identifies Potential Responders to ICI Therapies

高RvD评分确定ICI治疗的潜在应答者

既往研究报道，靶向HNSC的程序性细胞死亡蛋白-1 (PD-1)及其配体，患者并没有受益于这些药物。因此，选择适合免疫治疗的患者至关重要。文献报道PD-L1 (CD274)、细胞毒性t淋巴细胞抗原4 (CTLA4)、淋巴细胞激活基因3 (LAG3)、程序性细胞死亡蛋白1 (PDCD1)，可作为确定免疫治疗生物标志物。因此，作者比较了RvD高评分和RvD低评分患者的CD274、CTLA4、LAG3和PDCD1的表达水平(图1C)。分析显示，RvD评分高的肿瘤的所有4个靶点水平显著增加(图5A,B)，表明免疫治疗的反应更好。

此外，在HNSC的 RvD高评分队列中，多形核中性粒细胞 (PMN)的浸润水平也发生改变，可能与分化、刺激和免疫反应相关的通路激活增加(图6F)。

Higher RvD Scores Predicted Improved Anti-Tumor Immunity and Outcomes in HPV Negative HNSC

较高的RvD评分预示着HPV阴性HNSC抗肿瘤免疫和预后的改善

既往文献报道，HPV阴性HNSC与HPV阳性HNSC相比，预后和治疗反应存在差异。因此，确定RvD评分是否能识别具有较强的抗肿瘤免疫能力和较高生存率的患者亚群是至关重要的。作者根据cBioPortal报道的HNSC肿瘤的HPV状态进行筛选，并比较RvD评分。与HPV阳性HNSC相比，HPV阴性HNSC表现出更低的RvD评分，因此，HPV阴性患者预后差也可能部分归因于RvD通路发生改变(图7A)。此外，根据HNSC患者的RvD评分对HPV阴性患者进行分层，发现RvD评分较高的患者无病生存期延长，这也表明RvD通路在HNSC亚群中具有保护作用(图7B)。重要的是，在RvD评分较高的HPV阴性HNSC中，CD8 + T细胞抗肿瘤免疫的免疫治疗靶点和效应物水平增加(图7C,D)。因此，高RvD评分与预后好和CD8 + T细胞抗肿瘤免疫增强相关，提示RvD通路的可能通过增强白细胞功能抑制HNSC进展。

总结

作者建立了RvD评分来评估来resolvin通路在HNSC中可能参与的生物学过程。研究结果表明，对于HNSC患者，无论是HPV阳性还是阴性，RvD评分高的患者无病生存期更长，可能是由于该组患者CD8 + T细胞驱动的抗肿瘤免疫增强。