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实体瘤中淋巴细胞的有限渗透和杀瘤功能的耗尽仍然是癌症免疫治疗的一个巨大障碍。今天小编给大家带来一篇题为“Macrophage Membrane-Coated Nano-Gemcitabine Promotes Lymphocyte Infiltration and Synergizes AntiPD-L1 to Restore the Tumoricidal Function”（IF: 18.027）的文章。本文作者设计了一种巨噬细胞膜包被的纳米吉西他滨系统(MNGs)来促进淋巴细胞的渗透，然后协同抗PD-L1来重新激活耗竭的淋巴细胞。
PD-L1或PD-1检查点已被证明在各种实体和血液肿瘤类型中具有显著的治疗效果。但绝大多数患者无法从这种治疗方案中受益。ICIs的治疗结果在很大程度上取决于肿瘤中预先存在的淋巴细胞识别和杀伤癌细胞。然而，对于非炎症性肿瘤，会出现免疫沙漠，极大地限制了ICIs的反应。因此，如何促进淋巴细胞的渗入，增强抗肿瘤免疫能力，成为肿瘤免疫治疗的关键问题。
越来越多的数据表明，一些治疗药物可以破坏肿瘤间质屏障或使混乱的肿瘤血管正常化、诱导癌细胞的免疫原性细胞死亡和趋化因子的升高。还可以消除各种免疫抑制细胞，下调多种促肿瘤细胞因子，使抑制性肿瘤微环境重新编程为抗肿瘤功能，很大程度上ICI介导的免疫治疗。然而，由于肿瘤间质致密性，这些药物在肿瘤内的传递和给药的严重挑战。
因此作者设计了一中仿生递药系统MNGs能有效促进肿瘤内渗透，增强肿瘤对癌细胞的亲和性，激活反应性药物释放，发挥免疫调节作用，从而协同抗PD-L1，使耗竭状态的浸润性淋巴细胞恢复杀瘤功能，产生显著的治疗效益。
吉西他滨(Gem)是一种有效的化学免疫调节分子，可以消除多种免疫抑制细胞，增强免疫识别，促进NK细胞的激活。将其设计成组织蛋白酶B敏感的疏水脂肪前药(C14-Gem)。MNGs是通过将巨噬细胞膜（MM）伪装到由pH敏感的聚合物PEG-PDPA和C14-Gem组成的纳米吉西他滨系统（NG）上而开发的。与NGs不同的是，MNG呈现出典型的core−shell球形纳米结构，MM的蛋白质组成大部分保留在MNG中(图1a,b)。同时，MM中CD11b、CCR2和ATPase的典型信号在MNG中很容易观察到(图1c)。MNG可以保持巨噬细胞有趣的趋瘤特性。高效液相色谱法（HPLC）测定了C14-Gem在NGs和MNG中的封装效率(EE)，表明它们在模拟生理液体中的良好稳定性(图1d)。HPLC分析表明C14-Gem在细胞内酸性环境中具有响应性的释放行为(图1e)。NGs和MNGs在pH 5.5的介质中纳米结构崩溃(图1f)。
此外，当C14-Gem在pH为5.5的介质中与组织蛋白酶B孵育时，C14-Gem能有效地降解为活性Gem。证实了组织蛋白酶B在C14-Gem降解过程中的重要作用。因此，MNGs可以在细胞内酸性环境中迅速释放C14-Gem，然后被组织蛋白酶B以编程方式降解为活性Gem，发挥药理活性。
在4T1乳腺癌模型中检测MNGs和NGs在肿瘤中的蓄积。用DiIC18(DiI)荧光探针标记NGs和MNGs。NGs和MNGs的DiI在不同时间点的肿瘤部位均有明显的红色荧光信号。体外成像证实，这两种纳米载体的优势肿瘤聚集(图2a，b)。然后，用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)成像测定肿瘤内的渗透曲线。在肿瘤组织的横断面上，MNGs的荧光信号强度远高于NGs(图2c，e)。然后，CLSM来评估了MNGs从肿瘤血管外溢到周围肿瘤实质中的情况，NGs主要局限于肿瘤血管周围(图2d)。MNG的红色荧光信号在肿瘤血管周围明显可见，并在距离肿瘤血管管腔200μm处仍保持高强度。而神经生长因子主要位于肿瘤血管周围40μm以内，且随着肿瘤血管距离的增加，其荧光强度明显降低(图2f)。这些数据证实了MNGs在肿瘤内渗透和肿瘤血管外渗方面的显著效果。
之后，作者评估了在稳定表达绿色荧光蛋白(4T1-GFP)的4T1癌细胞诱导的肿瘤中，MNG对癌细胞部分的可及性（图2g，h）。巨噬细胞通过NGs的肿瘤内转运和癌细胞可及性的增强可能归因于巨噬细胞模仿肿瘤的亲和性。
关于Gem的免疫调节作用，作者评估了它们在4T1肿瘤模型中重新编程STM的效果。首先测量了MNG在消除这些免疫抑制细胞方面的效果(图3a)。与阴性对照相比，MDSCs、Tregs和M2样TAM的频率分别降低了67.96%、32.18%和73.11%(图3b−e，)，表明MNG对清除肿瘤中多种免疫抑制细胞具有显著效果。随后，检测了MNG对TGF-β1和IL10产生的影响(图3f，g)。MNG能有效地清除抑制性免疫细胞，降低前列腺癌组织中TGF-β1和IL10的水平，具有显著的缓解STM的作用。
通过免疫荧光方法研究了MNGs对肿瘤中PD-L1表达的影响。在MNG处理组，PD-L1的红色荧光信号在4T1-GFP癌细胞及其邻近区域广泛检测到，其强度远高于其他处理组(图3h)。MNG治疗后PD-L1表达的增加可以促进抗PD-L1介导的抗肿瘤免疫治疗。
淋巴细胞在肿瘤中的渗透和向癌细胞巢的转运是肿瘤免疫治疗的基本前提。CD8+T细胞和NK细胞是实现肿瘤杀伤功能的主要效应细胞。用流式细胞仪检测各组4T1肿瘤患者外周血中CD3+CD8+T细胞和NK细胞(图4a-c)。此外，肿瘤细胞分泌TNF-α和IFN-γ分别是相应的NG治疗组的1.6倍和1.31倍(图4d)。这些数据证实了MNG治疗能提高肿瘤中CD3+CD8+T细胞和NK细胞的频率。
在激光共聚焦显微镜下用免疫荧光染色方法检测CD8+T细胞在癌巢中的浸润情况(图4e)。在MNG处理组，CD8+T细胞广泛分布在癌细胞区附近和高荧光强度的巢穴内。同样，检测了NK细胞在肿瘤中的渗透情况(图4f)。结果表明，MNG可显著促进CD8+T细胞和NK细胞向肿瘤细胞部分的转运。
然后，探讨了MNG促进肿瘤淋巴细胞浸润的可能机制。肿瘤细胞的浸润主要与肿瘤血管的供应、肿瘤间质的阻碍和趋化因子的分泌有关。在MNG处理组，CCL5、CXCL9和CXCL10的表达分别是阴性对照组的4.35、2.82和5.31倍，是NG处理组的1.92、2.05和2.44倍（图4g）。因此，MNG诱导的淋巴细胞趋化因子的上调可能是促进肿瘤中淋巴细胞浸润的主要因素。
之后，评估了MNGs及其联合抗PD-L1在三种小鼠肿瘤模型（4T1乳腺癌模型、PANC02胰腺癌模型和CT-26结肠癌模型）中的抗肿瘤效果。其中4T1和PANC02为低免疫原性肿瘤，淋巴细胞浸润少，PD-L1表达低，而CT-26肿瘤为高免疫原性肿瘤。在这三种模型中，MNGs的抗肿瘤作用并没有显著增强。MNG治疗组肿瘤逐渐发展，达到极限死亡体积，与PBS对照组相比，生存期适度延长。当它们与抗PD-L1联合使用时，在这三种肿瘤模型中，MNGs+抗PD-L1组的肿瘤体积明显小于MNG或抗PD-L1单独治疗组。与MNG或抗PD-L1单一治疗相比，无论是在低免疫原性的4T1和PANC02肿瘤模型中，还是在高免疫原性的CT-26模型中，MNGs+抗PD-L1治疗都显著延缓了肿瘤的进展，并明显延长了总生存期(图5)。这些数据有效地证实了MNGs在协同抗PD-L1介导的癌症免疫治疗方面的显著效果。
尽管MNG治疗促进了肿瘤中淋巴细胞的浸润，但其中很大一部分处于衰竭状态。与相应的NGs相比，MNG治疗的肿瘤中PD-L1检查点的上调和浸润性淋巴细胞的耗尽可能是抗肿瘤疗效改善有限的主要原因。作者重点研究了MNGs+抗PDL1治疗对4T1肿瘤中这些浸润性淋巴细胞状态和功能的影响(图6)。MNGs+抗PD-L1处理组中PD-1 CD3+CD8+PD-1+T细胞的比例显著降低，CD3+CD8+granzyme-B+ T细胞和CD3+CD8+IFN-γ+ T细胞增加(图6a，b)。同时，测量了它们对4T1肿瘤中浸润性NK细胞状态和功能的影响(图6E−h)。因此，MNGs与抗PD-L1联合应用可有效恢复肿瘤中浸润性淋巴细胞的杀瘤功能，有利于增强其抗肿瘤活性。
在原位胰腺癌模型和原位结肠癌模型中检测了MNGs+抗PD-L1联合治疗的疗效。与其他治疗方法相比，MNGs+抗PD-L1治疗可明显降低荧光素标记肿瘤的信号(图7a)。MNGs+抗PD-L1联合治疗显著延长了生存时间和生存率(图7b)。在CT-26诱导的原位结肠癌模型中，MNGs+抗PD-L1治疗组的中位生存期为56天，显著高于其他组。这些数据证实，在这两种原位肿瘤模型中，MNGs+抗PD-L1联合治疗比其他治疗方法有更好的治疗效果。
综上所述，作者设计了一种巨噬细胞膜包裹的纳米吉西他滨系统（MNG），以促进淋巴细胞的渗透，并协同抗PD-L1来重振耗尽的淋巴细胞，从而有效地治疗癌症。在4T1肿瘤中，MNGs表现出灵活的渗透性，并缓解了免疫抑制。此外，MNGs增强了肿瘤中淋巴细胞的浸润，但却意外地增加了肿瘤中耗尽淋巴细胞的比例，并增加了PD-L1的表达。MNGs联合抗PDL1有效地恢复了浸润性淋巴细胞的杀癌作用，并在几种肿瘤模型中产生了显著的治疗效果。因此，MNG提供了一种策略来促进淋巴细胞的渗透，并协同抗PD-L1以恢复其对肿瘤的杀瘤功能，用于癌症免疫治疗。
