肿瘤分型分析一直是肿瘤研究的经典方向，小编今天就给大家分享一篇今年一月刚刚发表在Hepatology（IF：17.298）杂志上关于肝细胞癌分型分析的文章了。文章结合多组学数据，对肝细胞癌进行了分型分析，并基于这些亚类研究了肝细胞癌脂肪变性与免疫微环境之间的关联。

Multiomics identifies the link between intratumor steatosis and the exhausted tumor immune microenvironment in hepatocellular carcinoma

多组学研究识别肝细胞癌中肿瘤内脂肪变性与肿瘤免疫微环境耗竭间的关联

一、研究背景

肝癌在全世界范围内是第四大癌症相关死亡原因，而肝细胞癌（HCC）是原发性肝癌中最常见的亚型，也是一种具有多种病因的异质性疾病。目前，免疫治疗已经成为HCC的关键治疗策略之一，但其疗效仍然有限。因此，这篇文章为了识别免疫治疗敏感的HCC，对非病毒性HCC的分子异常和肿瘤免疫微环境（TIME）进行了详细分析。

二、文章摘要

该研究首先对113例非病毒性肝癌患者的肿瘤组织进行了RNA测序，并对69个已经被报道会在HCC发生变异的基因进行了癌症基因组测序。接着研究使用无监督分层聚类将非病毒性HCC分为3个亚类（I、II、III类），并进行了预后分析。结果发现I类预后最差并与TP53突变相关，而III类预后最好且与CTNNB1突变相关。研究也发现38%的非病毒性HCC具有高频率的瘤内脂肪变性和低频率的CTNNB1突变特征。此外，研究发现脂肪变性HCC占非病毒性HCC的23%，且其TIME表现出免疫富集但免疫耗竭的特征，其中包括T细胞耗竭、M2巨噬细胞及癌症相关成纤维细胞（CAF）浸润、PD-L1高表达和TGF-β信号激活。接着研究进行空间转录组分析发现在脂肪变性HCC中，M2巨噬细胞和CAFs与耗竭的CD8⁺ T细胞非常接近。研究进行体外实验也发现软脂酸（PA）诱导的HCC脂质积累会导致PD-L1表达上调，并促进共培养的巨噬细胞和成纤维细胞产生免疫抑制的表型。且核磁共振（MR）成像也证实脂肪变性HCC患者在经过抗PD - L1和抗VEGF抗体联合使用的免疫治疗后无进展生存期（PFS）明显延长。

三．文章的主要内容及结果

1. 多组学分析将非病毒性HCC分为三个预后亚类

文章第一部分对非病毒性HCC的多组学分类进行了介绍。该研究共纳入了113例非病毒性肝癌患者，并通过肿瘤RNA测序分析非病毒性HCC的分子异常。作者根据转录组的无监督分层聚类分析将患者分为3个亚类（I类、II类和III类）（图1A）。研究发现I类患者预后最差，而III类患者预后最好（图1B）。富集分析发现I类中细胞周期和有丝分裂相关的基因富集，且FOXM1和AURKB上调（图1A）；III类中免疫细胞激活相关基因缺失，而WNT-β-catenin信号通路基因GLUL、SPARCL1、AXIN2及GREB1上调，且树突状细胞向肿瘤细胞迁移相关基因CCL4和CCL5下调。接下来，研究对55例非病毒性肝癌患者进行了癌症基因组测序，检测了69个已经被报道会在HCC发生变异的基因。结果55个样本中有50个检测到体细胞突变，其经常在TERT启动子区域、CTNNB1和TP53观察到（图1C）。研究也发现I类与TP53突变相关，III类与CTNNB1突变密切相关（图1C）。此外，作者也观察到TP53突变的非病毒性HCC患者预后最差，而CTNNB1突变的非病毒性HCC患者预后最好（图1D）。

2. 基于TIME的非病毒性HCC分类

接下来研究基于TIME对非病毒性HCC进行了分类。研究首先对肿瘤转录组进行了NTP（nearest template prediction）分析，并识别了在HCC中以强免疫细胞浸润为特征的免疫亚类。研究发现113个肿瘤中有43个被分类为免疫类，作者通过CIBERSORT分析也观察到这些肿瘤内总的免疫细胞和毒性T淋巴细胞（CTLs）丰度明显较高（图2A, B）。且研究也观察到这些免疫类主要富集在II类肿瘤中，其CTNNB1突变频率明显较低（图2C, D）。进一步研究发现CTNNB1突变的非病毒性HCC的瘤内免疫细胞浸润水平明显降低（图2E）。

3. 脂肪变性HCC免疫微环境呈现免疫富集但免疫衰竭

这一部分作者对免疫类相关的临床病理因素进行了分析。研究发现肝细胞癌中脂肪变性与免疫类密切相关，脂肪变性HCC占非病毒性HCC病例的23%（图3A），且瘤内免疫细胞总丰度明显高于非脂肪变性HCC（图3B, C）。接着ssGSEA和通路富集分析也发现脂肪变性HCC中T细胞耗竭特征和间质特征以及TGF-β信号的激活明显升高（图3C, D），这些都是肿瘤免疫耗竭的特征。此外，脂肪变性HCC还表现出多种参与T细胞耗竭的转录因子以及癌症相关成纤维细胞（CAFs）标志物上调（图3E）。进一步研究通过CIBERSORT分析发现脂肪变性HCC中存在大量的M2巨噬细胞浸润，且参与巨噬细胞M2极化和免疫抑制的细胞因子和趋化因子上调（图3C, E, F）。免疫组化分析也证实GPC3阳性肝癌细胞中PD-L1上调，非病毒性肝癌样本中CAFs和M2巨噬细胞大量浸润（图3G-J）。

4. 耗竭的T细胞、M2巨噬细胞和CAFs相互作用构成脂肪变性HCC免疫衰竭的TIME

这一部分作者通过空间转录组分析对脂肪变性HCC中的免疫耗竭TIME进行了刻画。研究将肿瘤切片分成1768个点（spots），并从每个点获取转录组数据。研究首先基于图聚类将所有点分成6个亚群，其中亚群2中免疫细胞群高表达（图4A-C）。ssGSEA分析也发现亚群2的基质特征和T细胞耗竭特征增强（图4C）。研究将CD8A和NR4A1双阳性点作为含有耗竭CTLs的点，结果发现几乎有一半的点包含在亚群2中（图4D）。接着研究比较了有或没有耗竭CTLs点之间的转录组谱（图4E），结果发现在CTLS耗竭部位M2巨噬细胞标记CD163和CAF标记VIM的表达增加，且TGFB1水平升高（图4F）。

5. PA诱导的肿瘤细胞脂质积累可能促进脂肪变性HCC的免疫抑制

这一部分作者研究了HCC中肿瘤内脂肪变性与免疫衰竭TIME之间的机制关联。研究首先进行了基于脂质组学的总脂肪酸谱分析，发现脂肪变性HCC样本中的PA水平明显高于非脂肪变性HCC。因此，作者在体外研究了PA积累对HCC细胞的影响。研究在Hep3B细胞中添加PA来诱导脂质积累（图5A），接着研究在mRNA和表面蛋白水平观察到PD-L1表达上调（图5B, C），且在mRNA和分泌蛋白水平也观察到CSF1、CXCL8和TGF-β1的上调（图5D, E），这些都被报道可以促进M2巨噬细胞的极化或激活CAFs。接着作者进一步观察到PA处理的Hep3B细胞在共培养的人巨噬细胞系（图5F）中上调CD206和IL10，在共培养的人肝星状细胞系中上调TGFB1（图5G）。此外，研究也发现免疫抑制细胞因子和趋化因子在体内脂肪变性HCC中也上调（图5H）。

6. 脂肪变性HCC患者对阿特珠单抗联合贝伐珠单抗的免疫治疗更敏感

由于脂肪变性HCC具有免疫富集但免疫衰竭的TIME并表现为PD-L1的高表达，因此在文章的最后一部分作者对脂肪变性HCC的免疫治疗应答进行了研究。研究首先通过核磁共振识别脂肪变性HCC。然后，研究对30例阿特珠单抗联合贝伐珠单抗治疗的晚期HCC患者进行了回顾性分析，这30例患者中有7例被分为脂肪变性HCC（图6A, B）。研究发现在5.4个月的观察期内，所有脂肪变性HCC患者均无疾病进展。因此，作者推测脂肪变性HCC患者的PFS明显长于非脂肪变性HCC患者（图6C）。

到这里这篇文章的主要内容就介绍完了，文章基于多组学数据对肝细胞癌中肿瘤内脂肪变性与肿瘤免疫微环境耗竭间的关联进行了分析。文章首先使用转录数据进行肿瘤分型，接着结合肿瘤脂肪变性这一临床病理因素进行了关联分析，并进行了实验验证。研究的核心还是我们熟悉的分型分析，不过结合了临床因素进行了详细的机制关联刻画，使文章有理有据，内容充实。小编觉得这种将病理因素与肿瘤亚型结合分析的研究角度值得小伙伴们参考呀。