如何利用免疫治疗数据来构建预后模型？

最近关于预后模型的文章层出不穷，如何从免疫治疗数据出发，建立可靠的预后标志物很重要。今天给大家分享一篇2022年1月20日发表在Aging（IF=5.955）上的文章，通过探索免疫相关的特征来预测结肠癌患者的免疫治疗反应性、预后和诊断。

一 研究背景

结肠癌是世界上死亡率最高的恶性肿瘤之一，目前在肿瘤筛查、早期诊断和治疗方面有所进展，但结肠癌的预后依然有很多挑战。近年来，越来越多的研究探讨了肿瘤免疫微环境的功能，它可能在肿瘤发生中发挥重要作用。此外，许多研究已经确定了肿瘤微环境中的免疫相关特征，用于预测各种癌症的预后，包括结肠癌。

免疫治疗，尤其是免疫检查点抑制剂（ICI），主要是利用宿主的免疫系统来对抗肿瘤的发展和转移，达到控制和消除肿瘤的目的，这对结肠癌的治疗起到了革命性的作用。然而，对ICI的反应率很少超过20%，这取决于几个关键因素，包括突变负荷、肿瘤浸润淋巴细胞和调节检查点受体。然而，用于预测结肠癌患者免疫治疗反应性的分子标志物的研究是有限的。

因此，探索有效的新型分子标志物来预测结肠癌患者的免疫治疗反应性、预后和诊断至关重要。本研究重点关注在抗PD-L1队列中发现的免疫相关特征，并系统地探讨了它们在预测结肠癌患者的预后、免疫治疗反应性和诊断方面的表现。首先，利用edgeR软件包，通过比较抗PD-L1队列中的应答者和非应答者，确定了免疫治疗反应相关的差异表达基因（DEGs）。然后，将免疫治疗反应相关的DEGs与免疫相关基因（IRGs）相交，得到免疫治疗反应和免疫相关基因（immune-related genes , IRIGs）。然后，基于癌症基因组图谱（TCGA）数据库中的COAD队列，利用单变量Cox回归分析和多变量Cox回归分析构建了由6个IRIGs组成的免疫治疗反应和免疫相关风险评分（IRIRScore）模型，并在两个独立的基因表达数据库（GEO）数据集（GSE39582和GSE17536）和抗PD-L1队列中进一步验证。此外，免疫相关的特征被应用于使用随机森林算法建立预测模型。其中，TDGF1和NRG1显示出优秀的诊断预测性能（AUC>0.8）。总之，目前的研究结果为免疫相关的免疫治疗反应性、预后和结肠癌的诊断提供了新的见解。图1显示了本研究的整个分析流程。表1展示了抗PD-L1数据集的详细信息。

二 主要结果

识别IRIGs

通过比较抗PD-L1队列中的应答者和非应答者，作者发现了1323个免疫治疗反应相关的DEGs（634个上调，689个下调）（图2A。与1509个免疫相关基因（IRG）交叉后，得到108个IRIGs（图2B）。KEGG分析结果显示，IRIGs在细胞因子-细胞因子受体相互作用、神经活性配体-受体相互作用、JAK-STAT信号通路、cAMP信号通路、PI3K-Akt信号通路等相关功能上明显富集（图2C）。此外，GO富集分析表明，IRIGs富集到与激素相关的功能，包括体液免疫反应、抗微生物体液反应、激素分泌调节和激素运输（图2D）。

建立免疫相关预后模型

作者探索了结肠癌患者的有效预后特征。基于训练数据集，对IRIGs进行了单变量和多变量的Cox回归分析，发现6个基因与整体生存状态显著相关（表2）。

各项预后指标的系数和危险比（HR）分别显示在图2E和,2F。TDGF1、IL13RA2和NRG1是保护因素（HR<1），而CRLF1、GRP和IL20RB是风险因素（HR>1）。然后，计算每个病人的IRIRScore。图2G的散点图显示，低风险组患者的生存时间比高风险组长，这也得到了图2H的明显支持（P < 0.0001）。图2G的热图显示，危险因素在低危组的表达量低，在高危组的表达量高，而保护因素的趋势则相反。IRIRScore模型在3、4、5年的OS的AUC分别为0.659、0.677和0.653（图2I）。肿瘤尺寸较大的患者比肿瘤尺寸小的患者产生更高的IRIRScore（Kruskal-Wallis检验，P = 3.9e-6，图3A）。有转移的患者的IRIRScore高于无转移的患者（Kruskal-Wallis检验，P = 0.012，图3B）。有更多的远处或更多的淋巴结参与的患者，其IRIRScore更高（Kruskal-Wallis检验，P = 3.2e-5，图3C）。晚期患者的IRIRScore高于早期患者（Kruskal-Wallis检验，P = 0.00016，图3D）。图3E显示，IRIRScore较高的患者产生的微卫星状态更不稳定（Kruskal-Wallis检验，P = 0.015，图3E）。

在预测预后和免疫治疗反应方面验证和评估已识别的免疫相关特征

为了验证所确定的免疫相关签名是否适用于不同的队列，在两个独立的GEO数据集（GSE39582和GSE17536）中，基于训练数据集的相同方法计算每个患者的IRIRScore。基于测试数据集，高危组患者的OS率明显低于低危组。基于GSE39582的检测数据，Kruskal-Wallis检验显示，较高的IRIRScore与较高的T期（P = 0.00038）、转移（P = 0.011）、N期（P = 0.0015）和晚期病理阶段（P = 0.021）有关。此外，基于抗PD-L1队列，作者发现对免疫疗法敏感的患者的风险评分明显低于非反应者，表明反应者的OS将比非反应者更好。

列线图的构建和验证

为了提高IRIRScore模型性能的准确性，并为预测结肠癌患者3、4、5年的OS概率提供一种定量和可视化的方法，作者构建了一个预后列线图。在列线图中，很容易估算出每个变量在积分制上的得分，并计算出3、4、5年后的生存概率（图3F）。与其他变量相比，IRIRScore的得分点最高。森林图显示，包括年龄（>60岁）、晚期病理阶段（III和IV）和IRIRScore在内的变量与OS明显相关（P<0.05，图3G），但微卫星状态、StromalScore和ImmuneScore则没有（P>0.05）。为了验证提名图的预测性能，作者绘制了校准曲线，观察到预测曲线接近于理想曲线（图3H-3J）。此外，提名图的预测准确性（C-指数）已从0.63大幅提高到0.75，表明模型的功能良好。

探索潜在的免疫治疗相关签名

作者使用CIBERSORT方法估计了训练数据集中结肠癌患者22种免疫细胞的比例。随后，使用Kruskal-Wallis检验比较了高危组和低危组之间的免疫细胞类型的组成。此外，在T细胞CD8、T细胞CD4记忆静止、T细胞CD4记忆激活、T细胞滤泡辅助、T细胞调节（Tregs）和嗜酸性粒细胞中发现了明显的差异（P < 0.01，图4A）。Kaplan-Meier曲线显示，高水平的T细胞调节性（Tregs）与不良的OS显著相关（P = 0.029，图4C），而高水平的T细胞CD4记忆静止与更好的OS显著相关（P = 0.0071，图4B）。22种肿瘤浸润性免疫细胞中有10种与IRIRScore明显相关（P＜0.05）。其中，T细胞调节性（Tregs）、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞M1、T细胞滤泡助手、T细胞CD8和巨噬细胞M2与IRIRScore呈正相关，而树突状细胞激活、浆细胞、T细胞CD4记忆激活和T细胞CD4记忆休息与IRIRScore呈负相关。

作者接下来使用maftools R软件包对高危组和低危组的突变情况进行了绘制和比较。前20个明显突变的基因是APC、TP53、TTN、KRAS、SYNE1、MUC16、PIK3CA、FAT4、RYR2、OBSCN、ZFHX4、DNAH5、PCLO、CSMD3、ABCA13、DNAH11、LRP1B、FAT3、USH2A和CSMD1（图4D）。其中，APC的突变率在低风险组明显较高（P = 0.000716，图4E），而MUC16的突变率在高风险组明显较高（P = 0.0154，图4E）。然而，APC或MUC16的突变状态与患者的OS没有明显关联（图4F）。此外，作者还计算了每个样本的TMB值，并将其可视化（高危组的中值：2.66/MB；低危组的中值：2/MB，图4G）。如图4H所示，高危组患者的TMB值明显高于低危组患者（P = 0.00031）。此外，应用Wilcoxon检验对两组之间的免疫检查点抑制剂靶点的表达进行统计学比较。结果发现，高危组的表达水平明显较高（P < 0.001，图5）。

识别的IRIGs作为潜在的诊断生物标志物

作者发现6个IRIGs中的5个在肿瘤和正常样本之间有明显的差异表达（P < 0.05，图6A）。其中，TDGF1和GRP在肿瘤样本中上调，而NRG1、CRLF1和IL20RB在肿瘤样本中下调。用RF算法建立预测模型，用ggroc R软件包计算并绘制每个IRIG的AUC（IL13RA2：0.579；TDGF1：0.813；NRG1：0.933；CRLF1：0.795；IL20RB：0.625；GRP：0.724，图6B）。其中，TDGF1和NRG1显示出优秀的诊断预测性能（AUC>0.8）。图6C-6F显示了CRLF1、NRG1在蛋白水平上的分布和表达。

三. 总结

在这项研究中，作者首先利用免疫治疗数据识别出一些癌症预后相关的免疫分子特征，以预测结肠癌的免疫治疗反应性、预后和诊断，并在多个队列中验证了所发现的预测预后和TNM分期的免疫相关特征。总体来说，这篇文章是一个不错的预后分析思路，值得大家借鉴！

参考文献

Cao L, Ba Y, Yang J, Zhang H. Exploring immune-related signatures for predicting immunotherapeutic responsiveness, prognosis, and diagnosis of patients with colon cancer. Aging (Albany NY). 2022 Jun 20;14(12):5131-5152. doi: 10.18632/aging.204134. Epub 2022 Jun 20. PMID: 35748788; PMCID: PMC9271306.