单细胞技术在国内外成为了热门科研领域研究的技术手段新宠。结合近年来的研究进展,可以看到单细胞测序对于肿瘤免疫治疗等新手段可以提供巨大帮助。今天给大家分享一篇近日发表在GenomeBiology(IF:13.583)发表了应用单细胞转录组测序全景式刻画肾透明细胞癌原发肿瘤和癌栓的肿瘤微环境差异的研究成果。文章的逻辑思路清晰,很多分析思路值得借鉴。
一、研究背景
在晚期肾细胞癌(RCC)中经常发生伴有瘤栓的血管侵犯。血栓切除术是最具挑战性的手术之一,具有较高的围手术期发病率和死亡率。然而,人们对驱动瘤栓形成的机制知之甚少。因此亟需提高对肾癌和癌栓的深入认识,解析癌栓发生发展机制,为患者提供更加有效的新辅助治疗方案。
二、研究思路
三、结果
1.肿瘤血栓和匹配的肾脏原发性肿瘤微环境的 scRNA-seq 分析
为了阐明静脉瘤栓中的肿瘤生态系统,研究人员从8名未接受治疗的ccRCC患者中收集了19个手术组织标本用于scRNA-seq,包括瘤栓(TT,n=8)、成对的原发性肿瘤(PT,n=8)和癌旁组织(ART,n=3)(图2a)。此外,研究人员从140,805个细胞中获得了大约10亿个独特的转录本:62,035个细胞来自TT,58,695个细胞来自PT,20,075个细胞来自ART(图2b)。过滤后,共有约12万个细胞通过UMAP方法分为9种主要细胞类型:上皮细胞、T细胞、自然杀伤(NK)细胞、骨髓细胞、肌成纤维细胞、内皮细胞(EC)、B细胞、浆细胞和肥大细胞(图2c-f)。
经过分析,样本细胞类型比例直方图结果表明ART、PT和TT样本之间生态系统组成的显著异质性(图2g)。
接下来,研究人员将继续对关键的细胞亚型,做进一步的聚类和差异表达基因分析。
2. 原发性肿瘤和肿瘤血栓中 T/NK 细胞的聚集和状态分析
由于近期研究发现经过免疫检查点阻断(ICB)治疗后ccRCC患者的瘤栓显着减少,故研究人员推测肿瘤浸润性免疫细胞可能在此过程中发挥重要作用。因此,首先对T和NK细胞进行了无监督聚类,并在ART、PT和TT中获得了12个subcluster(图3a-d)。为了确定ARTs、PTs和TTs之间的差异,研究人员计算了ARTs、PTs和TTs中每个簇的百分比,发现PTs中幼稚CD4+T细胞(CD4-C1)的相对百分比低于ART和TT,抑制性Tregs(CD4-C4)的比例更高(图3e),表明PTs可能处于更免疫抑制状态。对于CD8+T细胞,其与CD4-C1细胞的比例相似。此外,肿瘤组织中耗竭的CD8+T细胞(CD8-C3)的比例增加,但PT和TT之间没有显着差异。研究人员从轨迹的通路分析中得出,T细胞活化和淋巴细胞分化在较早阶段上调,细胞周期、ATP代谢和缺氧相关通路在CD8+T细胞的终态高度富集。结果表明,CD8+T细胞在PTs和TTs之间具有相同的过渡轨迹,伴随着功能失调和代谢紊乱,最终在PTs和TTs中都被耗竭。
有证据表明,某些处于祖细胞衰竭状态的CD8+T细胞可以增强ICB治疗黑色素瘤和肾癌的疗效,此外存在部分ccRCC患者使用ICB治疗后TT的显著消退,因此研究人员推测存在一些恢复的CD8+T细胞亚群可能类似于祖细胞耗竭的表型。研究人员根据已发表的研究对CD8+T细胞亚群的祖细胞和最终耗竭的基因特征进行评分。值得注意的是,CD8-C1子簇中的祖细胞耗竭特征显着富集,并且最终耗竭特征明显低于其他子集(图3f)。此外,大多数祖细胞耗竭的特征基因在TT样品中的CD8-C1细胞中表达上调(图3g),这进一步证明了祖细胞耗竭的表型富含TT。这些发现后续在独立验证队列数据中得到了再现(图3h)。
综上所述,原发性ccRCC和瘤栓中组织驻留CD8+T细胞的高特征可能是对ICB治疗反应良好的暗示。
3. 巨噬细胞在肿瘤血栓中表现出增强的 ECM 重塑活性,在原发性肿瘤中表现出免疫反应性扰动
先天免疫细胞可能是血管内TT快速扩展的第一道屏障,这可能对瘤栓形成和对ICB治疗的抵抗有重要影响。因此,研究人员分析了PT、TT和ART中16,267个骨髓细胞的转录组。骨髓细胞表现出显著的异质性,分为14个簇(图4a-c)。与ART相比,PT和TT中的中性粒细胞显着减少(图4d),这意味着PT和TT的肿瘤细胞可能逃脱循环中性粒细胞的消除。紧接着通过检查免疫检查点和免疫相关的基因表达水平,发现除中性粒细胞外,几乎所有免疫检查点和逃避相关的基因都在髓系亚群中高度表达(图4e)。这些结果表明,中性粒细胞可能更有效地对抗癌细胞,而其他巨噬细胞、单核细胞和 DC 可能已经被 PT 或 TT 肿瘤细胞“教育”。
值得注意的是,本次结果无法通过已知的标记基因清楚地区分促炎M1和抗炎M2巨噬细胞(图4f)。有趣的是,研究人员注意到促炎M1表型中的基因表达特征显着丰富(图4g),此外,与TT相比,PT中的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)还上调了免疫检查点和逃避标记的表达(图4h)。然而,在TT中,研究人员观察到与肿瘤进展相关途径相关的特征评分增加,包括上皮间质转化(EMT)、细胞外结构组织和血管生成。
总的来说,TAM的复杂性表明PT和TT之间存在明显的功能障碍状态,PT中具有更强的免疫抑制表型,并且TT中的ECM重塑增强。
4. 原发性肿瘤和肿瘤血栓中恶性细胞的鉴定和表征
研究人员试图确定PT和TT之间恶性细胞的鉴定与表征。
首先他们使用肌成纤维细胞和内皮细胞作为参考对scRNA-seq数据进行InferCNV分析检测证实了肿瘤细胞。8名患者中有7名在TT和PT之间显示出相似的CNV模式和亚克隆结构(图5a-b)。
接下来,研究人员评估了PT和TT之间恶性细胞的转录差异。通过比较了恶性细胞和近端肾小管细胞的缺氧和血管生成特征,结果发现,PT和TT恶性细胞的缺氧和血管生成特征明显高于来自ART的细胞。
此外,研究人员针对15,012个PT的恶性上皮细胞和12,078个TT恶性上皮细胞进行聚类(图5c-e),对四个簇进行了基因表达差异分析,随后通过GSVAHallmark进行分析,并观察了每个簇之间显著的转录过程差异(图5f)。有趣的是,与TAM相似,研究人员观察到参与干扰素-γ(IFN-γ)反应和抗原呈递途径的基因富集,与TT相比,PT中免疫检查点和逃避基因的表达上调(图5g-h)。
综上所述,结果表明PT中的恶性细胞表现出更强的免疫抑制表型,而TT中的肿瘤细胞表现出更高的ECM重编程状态。
5. TT,PT 和 ART 中内皮细胞和肌成纤维细胞的详细表征
为了进一步评估可能促进瘤栓在血管内生长和扩展的内皮细胞作用,研究人员针对内皮细胞(EC)进行了聚类,将这些细胞分为六个不同的簇(图6a-c)。
此外,研究人员发现(图6d-g):
1)TTs中Endo2的比率高于ARTs和PTs,表明与癌症相关的脉管系统形成可能有助于TT在血管内空间中的快速延伸,在独立验证集合中也观察到TT中Endo2子集的百分比显著增加。
2)高水平的Endo2基因特征与TCGAKIRC队列中的低生存率显着相关。
3)与PT的EC中的干扰素反应和抗原结合途径相关的表达特征显着增加,但伴随着与免疫抑制相关的基因表达在PT和TT之间的EC子集中的变化。
4)在Endo2亚群中,与TT相比,PT中大多数与免疫抑制相关的基因的表达水平上调,表明PT中的这些细胞可能处于更免疫抑制状态。
5)EC在TT中具有增强的ECM重塑和细胞增殖活性。
研究人员进一步研究了ART、PT和TT中的成纤维细胞,通过聚类10,726个肌成纤维细胞发现了五种不同的亚型(图6h-j),结果表明Myo2可能有助于将肿瘤血管重塑为瘤栓中的成熟表型。
综上所述,除了TAM和TT中的癌细胞外,TT中的内皮细胞可能会修饰ECM以促进瘤栓的生长,而针对具有Endo2特征的细胞的分子疗法可能能够特异性地降低腔静脉血栓的阶段。
6.肿瘤-基质相互作用重塑了与存活率低相关的肿瘤血栓中的细胞外基质
首先,鉴于与PT相比,活化的ECM重塑作为TT的巨噬细胞、恶性细胞、EC和肌成纤维细胞的共同趋势的观察结果,研究人员假设不同的细胞群参与了复杂的串扰。为了识别可能的非细胞自主效应,研究人员使用CellPhoneDB通过已知的受体-配体对识别不同细胞群之间的假定信号传导。与ART和PT相比,ECM重塑途径中多个配体-受体对的相互作用在TT中更强,并且预测肌成纤维细胞具有与肿瘤细胞和EC显着相互作用的最强信号,并在独立验证集中验证了这一发现(图7a-b)。
接下来,鉴于肌成纤维细胞与恶性细胞和内皮细胞之间的强相互作用,研究人员检查了肿瘤细胞是否控制基质肌成纤维细胞的募集。通过将scRNA-seq与bulk RNA-seq进行联合分析,结果表明肿瘤细胞可能通过分泌 ECM 相关成分在 TT 中募集更多的肌成纤维细胞。此外,研究人员还发现肌成纤维细胞在 TT 中比在 PT 中增强了 ECs 的募集,这可能潜在地促进血管生成(图7c-g)。
综上所述,研究人员发现瘤栓中更强的肿瘤-基质相互作用伴随着肿瘤细胞和基质细胞中一组特定的 ECM 相关基因和通路的上调表达。
最后,为了进一步研究肿瘤-基质相互作用与患者预后之间的关联,研究人员使用显着的 L-R 对计算肿瘤细胞与肌成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞之间的肿瘤-基质相互作用评分,结果表明,肿瘤-间质相互作用与透明肾细胞癌患者生存期降低显著相关(图7h)。
四、讨论
在晚期肾细胞癌 (RCC) 中经常发生伴有肿瘤血栓的血管侵犯。肿瘤血栓水平对手术的复杂性有重大影响。然而,人们对驱动肿瘤血栓形成的机制知之甚少。本次研究提出了一个全面的单细胞转录组图谱,揭示了原发性肿瘤和配对肿瘤血栓中肿瘤细胞、免疫细胞和基质细胞的异质性。研究人员在本次研究中解决了如下问题:
1. 根据单细胞转录组测序的结果,进行无差别聚类,重新定义肾脏原发性肿瘤和肿瘤血栓微环境中的各种细胞类型。
2. 通过scRNA-seq 揭示了原发性肿瘤和肿瘤血栓中细胞的异质性。
3. 通过scRNA-seq可以了解肾透明细胞癌背后的机制,为进展期肾癌治疗和缩减癌栓提供潜在治疗通路及靶点。
4. 鉴定细胞自主反应和非细胞自主反应。
参考文献
[1] Shi, Y., Zhang, Q., Bi, H. et al. Decoding the multicellular ecosystem of vena caval tumor thrombus in clear cell renal cell carcinoma by single-cell RNA sequencing. Genome Biol 23, 87 (2022). https://doi.org/10.1186/s13059-022-02651-9