大家好呀，今天小编给大家带来的一篇今年二月发表在Frontiers in Endocrinology(IF=6.055)上的一篇文章。题目：“Integrating single-cell RNA-seq and bulk RNA-seq to construct prognostic signatures to explore the role of glutamine metabolism in breast cance”作者基于谷氨酰胺代谢相关基因，整合单细胞及bulk RNA-seq数据，构建了一个预后signature。这是一篇很典型的模板分析范文，快来和小编一起学习一下吧！

一.研究背景

乳腺癌(breast cancer,BC)是女性发病率第一的癌症。近几十年来，乳腺癌的治疗策略已由传统的根治性乳腺切除术联合放化疗向新辅助化疗、内分泌治疗、靶向治疗联合手术等综合多模式治疗转变，但由于患者异质性较高，部分患者仍然无法从常规治疗中获益，生存预后较差。谷氨酰胺和谷氨酸是非必需氨基酸，是合成氨基酸、脂类和核酸所需氮和碳的主要来源，但对肿瘤细胞的代谢过程很重要。侵袭性癌症，如三阴性乳腺癌(TNBC)，其恶性表型特征之一是谷氨酰胺的代谢。利用谷氨酰胺代谢相关基因预测治疗疗效和临床预后值得进一步研究。因此，本篇文章基于谷氨酰胺代谢相关基因(GRGs)，通过分析乳腺癌单细胞RNA-seq及bulk RNA-seq数据构建了一个谷氨酰胺代谢的预后signature，以期为BC的诊断和治疗提供新的视角。

二.主要结果

1.BC单细胞数据分析

图一展示了本研究的流程图。通过质量控制，降维聚类分群等单细胞数据处理操作后，10个样本的细胞共分为18个簇(图2A、B)。基于已知的细胞marker基因表达，将细胞注释为8种细胞类型，如内皮细胞、肥大细胞、成纤维细胞和肿瘤细胞(图2C、D)。接下来，作者通过R包AUCell计算了各细胞类型的GRGs活性打分，探讨GRGs的表达特征(图2E)。作者根据GRGs的AUC评分中位数将其分为高-谷氨酰胺AUC组和低-谷氨酰胺AUC组，结果表明，AUC值主要在巨噬细胞中较高(图2F)。

2.加权共表达网络分析与构建

在这一部分，作者通过WGCNA分析寻找与谷氨酰胺共变的基因集。如图3A所示，选择软阈值为6进行后续的分析；将相似度低于0.25的模块合并，最终生成12个非灰度模块(图3B、C)，作者发现，绿色和紫色模块(每个模块包含2,783个基因)与谷胱氨酸基因的关系最密切。为了进一步探索GRGs与BC患者预后的关系，作者将单细胞和Bulk-RNA分析中获得的影响谷氨酰胺代谢活性的最相关基因取交集，最终219个基因用于后续分析(图3D)。接下来作者在TCGA-BC的训练集上使用单因素回归分析确定预后基因；LASSO-Cox回归和多因素回归分析用于建立预后模型(图3E)。最终的预后模型包含21个基因，其中8个是危险因素，13个是保护因素(图3F)。

3.谷氨酰胺相关预后模型的验证和nomogram的构建

为了证明谷氨酰胺相关预后模型的可信度，作者进行了生存分析。结果表明，在训练、测试和所有队列的患者中，高危组患者的总生存率较低危组更低(图4A-C)；在外部验证集的GEO队列中也获得了相同的结果(图4D)。作者在训练队列和试验队列中进行ROC曲线分析，以进一步研究谷氨酰胺相关预后模型在评估BC患者预后中的准确性。结果表明，谷氨酰胺相关预后模型具有良好的预测效能(图4E-H)。

接下来作者利用临床信息和风险评分建立nomogram图(图4I)，校准曲线验证了nomogram图与作者的预测具有较好的一致性，与实际结果具有较好的一致性(图4J)。作者还进行了决策曲线和一致性指数研究，表明该nomogram在预测患者预后方面是有效的(图4K、L)。通过ROC曲线进一步评估nomogram的准确性，结果表明其准确性良好(图5A-C)。

4.突变景观分析

在这一部分，作者着重研究了高危组和低危组代表性基因的突变情况(图5D)。TP53、KMT2C、HMCN1、USH2A、DMD等基因在高危组中突变率居前五位。低危组突变率最高的前5位基因分别为PIK3CA、CDH1、MAP3K1、PTEN和GATA3。肿瘤突变负荷(Tumor mutation load, TMB)在两组间有显著性差异，高危组突变负荷高于低危组(图5E)。进一步分析显示，随着风险评分的增加，肿瘤突变负荷也相应增加，两者呈正相关(图5F)。对患者进行亚组分析后发现，高风险得分/高TMB组患者的生存预后较差(图5G、H)。

5.生物学功能和通路分析

在这一部分，作者主要探讨BC高危组患者预后不良的潜在机制。基因集变异分析(GSVA)结果显示，高危组中富集的hallmark包括糖酵解、Myc Targets V1、G2M检查点和E2F靶点;低危组富集特征包括炎症反应、IL6 jak stat3信号和干扰素γ反应等(图6A)。

高危样本可能通过上调糖酵解途径而导致BC患者预后变差；有研究表明高MYC靶点v1和v2评分与ER阳性BC中促癌和抗癌免疫细胞浸润增加有关。这些通路在BC高危组中更为普遍，可能在控制肿瘤发展中起着至关重要的作用。为了探索高危组和低危组样本的TME，作者使用ssGSEA来评估两个危险组之间的免疫细胞组成，如图6B、C显示，在高危组患者的肿瘤微环境中，免疫细胞浸润程度普遍低于低危组。

6.免疫景观与免疫治疗

为了进一步了解TCGA-BC队列中22种肿瘤浸润免疫细胞(TICs)的相对含量的分布和相关性，作者使用CIBERSORT方法测量了每个样本中的免疫细胞浸润水平。作者发现低危组的免疫细胞浸润总体高于高危组。NK细胞和T细胞CD4+在高危组浸润更多(图7A)。通过使用R包ESTIMATE，低危组的基质评分、免疫评分和ESTIMATE评分较高，表明该组的TME总体免疫水平和免疫原性较高。作者还分析了肿瘤纯度，结果显示两者呈正相关(图7B、C)。

接下来作者还进行了免疫检查点分析和免疫治疗反应评估，气泡图显示了模型基因和46个免疫检查点基因之间的相关性(图8A)，在高危组中仅观察到1个免疫检查点基因ICOSLG的表达(图8B)。作者发现，低危亚型的免疫表型得分(IPS)和检查点阻断评分高于高危亚型，突显出低危患者可能更适合接受免疫检查点抑制剂(ICI)治疗，并获得更显著的获益(图8C)。作者还进行了肿瘤免疫功能障碍和排除(tumor immune dysfunction and exclusion, TIDE)分析，结果表明高危组TIDE评分较低，风险评分与TIDE呈负相关(图8D)。

7.SNX3在BC样品中的表达

TCGA数据中SNX3的生存预后分析显示，SNX3高表达的乳腺癌患者预后较差(图9A)，且SNX3在BC组织中有较高的表达水平(图9B)，图9C显示了NX3的GO富集分析柱状图。作者在其自己的临床组织样本中发现了相同的表达趋势(图9D)。通过细胞培养实验，图9E显示转染MDA-MB-231和MCF-7细胞中SNX3的表达明显降低(图9E)。

接下来作者对SNX3基因进行了实验验证。敲低SNX3后，MDA-MB-231和MCF-7细胞株的集落形成能力显著降低(图10A)。在5-乙基-2脱氧尿苷(EdU)测定中，敲除SNX3，MDA-MB-231和MCF-7细胞系的增殖能力显著降低，提示SNX3可能促进增殖(图10B)。图10C,D中的Healing和Transwell实验表明，SNX3敲低后，细胞迁移和侵袭比紊乱的siRNA慢，表明敲低SNX3可能会减弱MDA-MB-231和MCF-7细胞株的迁移和侵袭。

至此，这篇文章就介绍完啦。总结一下，作者首先在单细胞和bulk RNA-seq数据中分析了谷胱氨酸代谢相关基因的表达情况，其次通过WGCNA分析得到了与谷胱氨酸代谢最相关的基因模块，并通过这些基因构建了一个预后打分模型。接下来就是大家常见的分组比较各种差异了，最后对SNX3这个预后基因进行实验验证，发现对其敲低降低了肿瘤细胞的集群和迁移侵袭能力。纵观全文，没有一个大家不会的生信方法，生信套路分析+简单实验验证永远是发文的利器！