今天给大家分享一篇2023年1月3日发表在Nature Communications （IF:17.694）上，局部晚期胃癌新辅助治疗/转化化疗相关的文章。

Neoadjuvant therapy with immune checkpoint blockade, antiangiogenesis, and chemotherapy for locally advanced gastric cancer

局部晚期胃癌的新辅助治疗/转化化疗

一．研究背景以及研究方法

免疫检查点抑制剂(ICI)和抗血管生成药物在晚期cT4a/bN+胃癌中具有一定疗效，但其在新辅助/转化治疗中的疗效尚不清楚。在这项单臂性II期临床试验(NCT03878472)中，作者评估了ICI (camrelizumab)、抗血管生成药(apatinib)和化疗药(奥沙利铂)联合应用于cT4a/bN+胃癌新辅助/转化治疗的疗效。

主要终点是病理反应。次要终点包括安全性、客观缓解、无进展生存期和总生存期。结果表明，完全和主要病理反应率分别为15.8%和26.3%。病理反应与微卫星不稳定状态、PD-L1表达和肿瘤突变负荷显著相关。此外，多组学整合分析揭示了几种病理反应的假定的生物标志物，包括RREB1和SSPO突变、免疫相关特征和外周T细胞扩增评分。多组学分析还表明了新辅助免疫治疗期间显性肿瘤亚克隆、免疫微环境和T细胞受体库(TCR)的动态变化。这些数据支持在大型随机试验中进一步验证基于ICI和抗血管生成的新辅助/转化疗法的疗效，并为其提供潜在的生物标志物。

二．研究结果

1、队列的样本临床信息以及术后评估

2019年5月至2021年8月，纳入25例患者，年龄在48至70岁，其中11例cT4aN+和14例cT4bN+。所有患者均完成了新辅助治疗和手术评估(图1b)。其中4例不能切除，2例拒绝手术，剩余19例患者接受手术，病理反应可评估。中位随访时间为24.7个月(图1 b)。

在11例cT4aN+胃癌患者中，9例(81.8%)达到了降期。3例(27.3%)患者出现部分缓解，8例(72.7%)患者病情稳定(图1c)。其中9例行R0切除术。由于手术中发现腹膜转移，两例切除为姑息性治疗(图1b)。中位随访26.7个月，9例根治性切除患者中有7例(77.8%)存活，5例(55.6%)无复发(图1d)。

在14例cT4bN+患者中，10例(71.4%)达到了降期。4例(28.6%)患者有部分缓解，10例(71.4%)患者病情稳定(图1c)。其中，8例(72.7%)行根治性切除，1例在手术中发现腹膜转移，3例经评估不能切除(图1b)。在随访中，8例根治性切除患者中有4例(50.0%)无复发，其中5例(62.5%)存活(图1d)。

图1：研究队列设计和临床疗效

2. 病理结果

对19例患者评估了病理反应。高微卫星不稳定性(MSI-H)、PD-L1阳性(CPS≥1)、ERBB2扩增和Lauren弥散型的基线频率分别为15.8%、16.7%、21.1%和52.6% (图2 a)。其中3例(15.8%)达到完全病理缓解(CPR)，5例(26.3%)达到主要病理缓解(MPR)，8例(42.1%)达到部分病理缓解(PPR) (图2 a)。MPR样本的形态变化包括细胞外粘蛋白池、纤维化和淋巴细胞浸润(图2d)。病理缓解与放射缓解患者具有大部分重叠，80%MPR患者放射部分缓解(图2b)。图2e的CT扫描图像显示了两例MPR患者(P1和P18)在新辅助治疗后的部分缓解。

在5例MPR患者中，2例MSI-H和PD-L1阳性，1例MSI-H和PD-L1阴性，1例微卫星稳定(MSS)和PD-L1阳性并伴有ERBB2扩增，1例基线时MSS和PD-L1阴性(图2a)。相比之下，非MPR患者均为MSS和基线PD-L1阴性。在新辅助治疗后，2例PD-L1阴性MPR和4例非MPR肿瘤转变为PD-L1阳性(图2c)。

作者通过多重免疫荧光进一步研究了1例MSS和PD-L1阴性的MPR病例(P18)和2例非MPR病例(P10和P20)(图2f)。在P18预处理样本中，肿瘤细胞密集分布，很少有PD-L1表达(图2f)。大部分CD8⁺ T细胞呈PD-1阳性。调节性T (Treg)细胞和巨噬细胞散乱分布。治疗后，肿瘤细胞变性疏松，呈巢状结构。细胞外黏蛋白池周围可见大量免疫细胞，尤其是CD8⁺细胞。许多间质细胞为PD-L1阳性，而肿瘤细胞仍为PD-L1阴性。此外，部分巨噬细胞与肿瘤细胞距离较近。在两例非MPR患者(P10和P20)中，治疗后也有CD8⁺ T细胞浸润，但程度低于P18。治疗前后标本中巨噬细胞增多，Treg细胞富集。WES和TCR测序显示，MPR治疗后标本中肿瘤突变负担(TMB)和肿瘤新抗原负担(TNB)下降(图2g-h)，超扩张T细胞克隆扩增(图2i)。

图2：病理结果

3. 基因突变与新辅助治疗疗效之间的联系

与TCGA STAD队列一致，该队列中最常见的发生突变的基因是TTN、TP53、SPTA1等(图3a)。某些突变在同一患者新辅助治疗前后同时存在，可能导致对治疗的耐药性(图3a)。基线时，MPR中的TMB和TNB明显高于非MPR肿瘤(图3a, b)。由于MSI-H与高突变负荷之间的联系，作者排除了MSI-H患者进行进一步的分析，发现MPR中的TMB和TNB高于非MPR肿瘤，但无统计学意义(图3c)。治疗后，整个人群的TMB显著下降，排除MSI-H或MPR患者后也明显下降(图3d)。考虑到TMB和肿瘤纯度之间可能的关联，作者进行了模拟来平衡处理前和处理后样本之间的肿瘤纯度。模拟后，这些患者肿瘤纯度调整后的TMB仍有显著下降(图3e)。为了更好地理解在治疗下进化过程中的突变选择，作者使用 “dNdScv”来估计非同义突变和同义突变的相对比率(dN/dS)，发现PPR患者治疗后dN/dS显著下降，提示阴性选择和亚克隆多样性降低。

在80%和80%的MPR基线样本中发现了RREB1和SSPO突变，但在0%和7%的非MPR样本中分别发现了RREB1和SSPO突变，这可能提示着二者可作为预测治疗的生物标志物 (图3a)。在TCGA STAD队列中，SSPO突变患者可显著延长了生存期，但在泛癌症队列中却没有(图3f)。

根据治疗前到治疗后肿瘤VAF纯度校正的变化，非同义突变被分为四种亚型，“增益”(仅发生在治疗后样本)、“丢失”(仅发生在治疗前样本)、“增加”(治疗后VAF增加)和“减少”(治疗后VAF降低)。病理降期与“丢失”突变比例显著相关(图3g、3h)。

图3： 新辅助治疗后的基因组特征和克隆进化

4. 不同应答患者的差异基因表达差异

接下来，作者分析了转录组数据及其与应答的关系。作者在MPR和非MPR患者的基线样本中鉴定了209个差异表达基因(DEGs)。这些DEGs主要富集在维生素和脂肪代谢、细胞间/基质粘附、I3K-Akt、MAPK、Ras和Wnt等多种信号通路中(图4a, b)。

在基线水平上，PPR样本中的免疫检查点基因(如CD274和CTLA4)和细胞毒性基因(如GZMB、NKG7和PRF1)水平明显高于非PPR样本(图4c、d)。在PPR患者中，新辅助治疗抑制了CD274、FOXP3、IDO1等免疫抑制基因，上调了CD8A、GZMH等细胞毒性基因，但这些差异无统计学意义(图4e)。

通过免疫相关的特征分析，发现在基线水平上，PPR患者的细胞毒性、IFN-γ和T细胞衰竭明显高于非PPR患者。新辅助治疗促进了PPR和非PPR患者的细胞毒性和CD8⁺效应信号，但没有显著性(图4f、g、4h)。

图4：不同反应患者的转录组特征

5. 不同应答患者的肿瘤微环境（TME）差异

该研究使用xCell用于估计TME中的23种免疫细胞类型(图5a)。在PPR肿瘤中，治疗后DC、CD8⁺ T细胞、T辅助细胞和M1巨噬细胞的比例增加，而Treg细胞减少(图5c)。在非PPR肿瘤中，DC、CD8⁺ T细胞和M1巨噬细胞的变化相似，但只有2例患者Treg细胞减少，4例患者Treg细胞上调Treg细胞(图5d)。随后，使用CIBERSORT确认了上述细胞的动态变化，并提供了细胞亚型的信息(图5b)。例如，M1和M2型巨噬细胞显著增加，而M0型巨噬细胞减少，反映了治疗期间从M0到M1/2的谱系分化(图5b)。

此外，作者还发现，在治疗过程中，所有PPR和非PPR (P03、P04、P08、P15和P20)肿瘤从“耗竭型”或“纤维化型”转变为“免疫型”或“免疫/纤维化型”(图5e)。他们还发现新辅助治疗后，所有PPR患者和部分非PPR患者(如P04、P08、P20、P21) 的效应细胞(EC)和MHC评分均升高(图5f)。然而，抑制细胞(SC)和免疫调节剂(CP)在这些非PPR患者中显著增加，而在PPR患者中保持稳定(图5f)。其余非PPR肿瘤(P07、P08、P11、P12、P15)治疗后无明显变化。

图5：免疫细胞反卷积及其与新辅助治疗反应的关系

6. 治疗期间T细胞克隆和TCR免疫组库的动态变化

随后，作者分析了这些患者的外周T细胞免疫组库(TCR)。结果显示，来自同一患者的样本共享的TCR序列最多，而不同患者之间共享的TCR只有一小部分(图6a)。然后，他们比较了4例PPR和6例非PPR患者TCR克隆性的动态变化(图6b)。作者根据前20个T细胞克隆的频率变化定义了克隆扩增(CE)评分。CE评分与病理降期显著相关;4例PPR患者均为阳性，6例非PPR患者均为阴性(图6c)。这表明应答者的T细胞克隆显著扩增，由此，作者推测CE评分可能是治疗应答的一个候选生物标志物。

作者还根据TCR频率将每个样本中的T细胞克隆分为四类，小(≤0.0001)、中(0.001-0.0001)、大(0.01 - 0.001)和超扩增(>0.01)(图6d)。在PPR患者中，治疗后超扩张克隆的频率显著升高，而小克隆的频率则降低(图6e)。在非PPR患者中未观察到这些差异。这些结果进一步表明，T细胞克隆扩增患者的病理反应优于其他患者。此外，作者研究了TCR 的V和J基因片段的使用情况(图6f, g)。治疗过程中观察到不同程度的V、J使用变化。TRBV20-1(图6f)和TRBJ -5(图6g)在MPR患者(P16和P18)中同时出现，而在其他患者中没有，这表明TRBV20-1和TRBJ -5可能有助于抗肿瘤免疫。

图6：T细胞免疫组库和动态变化

四、总结

该项II期试验中，作者的数据表明，基于ICI和抗血管生成的新辅助/转化治疗在cT4a/bN+胃癌，尤其是MSI-H和PD-L1阳性患者中具有良好的疗效和可行性。如何提高其在MSS和PD-L1阴性患者中的疗效有待进一步探索。多组学研究结果提供了一些候选的与疗效相关的生物标志物，并帮助理解治疗反应和耐药的机制。