大家好呀，今天分享的文章题为动态scRNA-seq分析揭示多发性骨髓瘤中与微环境重塑和药物敏感性相关的特异的肿瘤进程，于今年一月发表在《Cell & Bioscience》（IF = 9.584）上，文章有许多创新之处，让我们一起学习一下吧！

一、摘要

多发性骨髓瘤（Multiple myeloma（MM））是一种以恶性浆细胞克隆性增殖为特征的血液系统恶性肿瘤。 尽管进行了广泛的研究，但MM中驱动药物敏感性和临床结局的分子机制仍然难以捉摸。目前，使用蛋白酶体抑制剂（proteasome inhibitors（PIs））、免疫调节药物（immunomodulatory drugs（IMiDs））和单克隆抗体等治疗可有效缓解新诊断的MM（newly diagnosed MM，NDMM）的疾病严重程度并延长患者生存时间。本篇文章采用scRNA-seq技术研究了MM个体在硼替佐米-环磷酰胺-地塞米松（VCD）治疗前后的肿瘤异质性和分子动力学。发现在2个周期的VCD治疗后，未折叠蛋白反应（UPR）和代谢相关程序减少，而应激相关反应和免疫反应程序增加。同时发现肿瘤细胞免疫反应程序的低表达与MM中不利的药物应答和低生存率相关，这可能是由于MHC I类介导的抗原呈递和免疫监视的标记物下调以及与免疫逃逸相关的标记物的上调导致的。此外，结合免疫细胞谱分析，作者揭示了肿瘤内在免疫反应程序与微环境中免疫抑制表型之间的联系（其证据是T细胞、NK细胞和单核细胞的耗竭状态以及检查点分子和抑制基因的表达）。值得注意的是，YBX1的表达与骨髓瘤中免疫激活信号的下调和免疫细胞浸润的减少相关，从而导致不良预后。

二、结果

1、MM患者vs健康对照的单细胞表达图谱和细胞分型

使用10× Genomics对10名MM患者和3名健康对照的骨髓（Bone Marrow（BM））和外周血（PB）进行单细胞测序分析。MM患者采用VCD方案治疗，并在治疗后2个周期收集配对样本。共收集22份PBMC和22份骨髓单核细胞（BMMC）并进行scRNA-seq分析。去批次效应和质量筛选后共获得241440个高质量单核细胞，并根据标记基因鉴定了13种主要细胞类型。通过UMAP对细胞进行聚类发现免疫细胞和浆/骨髓瘤细胞明显分离，根据浆细胞的标记基因进行打分，浆/骨髓瘤细胞的得分更高。随后，作者分析了25231个浆细胞和216209个免疫细胞，并对MM中的肿瘤和免疫细胞异质性进行了综合分析。结果表明：一些前体细胞在BM中富集，而其他主要的免疫细胞都在PB中富集。还发现在接受VCD治疗的患者中，除了浆细胞外，B细胞的比例也降低了（基于免疫调节药物的治疗后的MM患者中发现同样的结果）（图1：A-C）。

2、MM中肿瘤间和肿瘤内异质性的识别

为了比较正常浆细胞（nPCs）和骨髓瘤细胞，本文将PC重新划分为20个不同的簇，结果显示MM患者之间存在很强的异质性，而来自健康对照的nPCs和少量MM细胞聚类在一起（cluster15），表明MM样本中存在nPCs。因此，作者通过CNV来区分骨髓瘤细胞和nPCs，使用来自健康对照的nPCs作为参考，估计了拷贝数的改变（CNAs），通过这种方式很好的区分了骨髓瘤细胞和nPCs。骨髓瘤细胞高度表达众所周知的驱动基因，包括CCND1、NDS2/MMSET、CCND3，通路分析显示，骨髓瘤细胞中多种生物学过程和通路显著上调，随后基于基因表达的层次聚类将骨髓瘤细胞分类为与其细胞遗传学一致的转录亚型。这些结果表明，骨髓瘤间的异质性可以通过众所周知的致癌驱动基因和不同的转录特征来解释（图1：D-E）。

为了进一步研究肿瘤内异质性（ITH），分别对每个MM患者的PCs进行聚类分析，并结合它们的CNA来检测总体ITH。CNA数量与细胞簇数量没有明显的相关性。接下来，作者通过每个MM患者的基因表达谱定义患者肿瘤细胞的ITH评分，发现每个患者的ITH评分明显不同。然而，平均ITH评分与聚类数或CNA均没有显著的相关性。用更大的数据集进行分析发现，复发MM的ITH评分明显高于新诊断的患者（NDMM）。生存分析显示，较高的ITH评分与较差的总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）相关。总之，ITH可以预测临床结果。

3、四种恶性细胞程序在治疗后发生失调

药物诱导的变化可能揭示化疗药物作用的分子机制，通过研究VCD治疗前后骨髓瘤细胞的整体基因表达谱，发现每个患者都表现出不同程度的肿瘤细胞丰度减少。ITH评分在治疗后也显示出明显的减少，可能是由于肿瘤细胞的消除。比较每个病人驱动基因，发现驱动基因表达减少与药物反应之间存在潜在联系。由于肿瘤间存在异质性，本文分别测定了同一受试者中每个治疗前和治疗后的肿瘤细胞之间的差异表达基因（DEGs）。对DEGs进行功能富集分析，并确定了化疗后MM患者共享的4个功能模块，包括UPR、代谢相关、应激相关和免疫反应。UPR和代谢的表达在处理后的样本中持续减少。应激反应得分在治疗后显著上升，表明化疗引起肿瘤细胞的应激反应，反过来可能有助于骨髓瘤抗凋亡和从药物靶向中恢复从而导致抗药；免疫反应激活途径相关的各种基因治疗后上调，表明治疗诱导的抗骨髓瘤免疫反应是由多种途径激活介导的。通过对肿瘤特异型调控网络的分析，发现了与治疗相关的关键转录因子（TFs），例如，XBP1和STAT3的调控活性降低，而治疗后的UPR和IL6-STAT3信号通路降低。相反，FOSB、MYC及其翻译调控因子YBX1在治疗后调控活性增加。其他与表观遗传调控相关的活性上调的转录因子（EZH2、SMARCA4和SETDB1）表明在治疗过程中存在染色体重塑（图2）。

4、低免疫反应程序预测MM的不良药物反应和预后

为了研究治疗后应激和免疫反应程序的增加是否在大队列中的疾病进展和治疗耐药性中发挥作用，本文对大量的MM样本队列进行评估，发现应激对患者预后的影响有限，因此作者关注的是免疫反应特征。通过对本研究中的肿瘤细胞进行评分，发现硼替佐米标准患者的免疫反应评分比良好的患者明显降低，这表明低免疫反应可能会影响药物敏感性。然后本文进一步测试了这一特征是否能影响患者的预后，发现低免疫反应评分与更差的OS和无进展生存期（PFS）显著相关。这些结果共同表明，免疫反应程序与不良的药物反应有关，从而导致肿瘤具有低水平的这种细胞状态的患者预后较差（图3）。

5、免疫反应较低的肿瘤细胞表现出免疫逃逸表型

在观察了免疫反应对MM临床结果的影响后，又探索了具有离散免疫反应评分的肿瘤细胞的转录谱，并确定了它们可能导致不良预后的差异。初步测定了每个患者的肿瘤细胞中免疫反应基因的表达评分，并根据评分将患者分成了高低两组。然后对两组进行通路分析，发现免疫反应评分低的肿瘤多种免疫反应通路下调，包括TNFα和IFN信号通路；而与细胞分裂、MYC信号通路和代谢过程相关的转录网络表达上调，为了进一步证实这种“免疫排斥”表型，又检测了调节免疫监视的基因的表达，发现MHC I类分子的表达显著降低，从而导致低免疫反应性肿瘤中的免疫监视受损。本文还检测了免疫抑制基因的表达，发现在低免疫应答骨髓瘤中免疫逃逸评分增加（CD47、LGALS1和TGFB1高表达）。这些结果表明，这些肿瘤具有活跃的细胞生长和增殖，以及逃避免疫补救细胞死亡的高能力（图4）。

6、肿瘤微环境中功能失调的免疫细胞的特征分析

本文探讨了治疗前后主要免疫细胞群体的变化，对每种细胞类型治疗前后的DEGs进行分析发现，大多数免疫细胞中IFN应答基因、应激相关基因表达下调以及相关通路下调；然而组蛋白相关基因在治疗后免疫细胞中上调；T细胞中的细胞毒性标志物，以及骨髓亚群中的促炎基因在治疗后表达上调。本文提取了MM中T细胞簇并划分成11个亚群，与高免疫应答肿瘤相比，CD8效应T细胞和IFN应答T细胞与NK细胞一起表现出明显的衰竭。此外，单核细胞在这些患者中也显示出免疫检查点和逃逸基因的表达增加。为了验证肿瘤内在免疫反应信号与T/NK细胞功能之间的关系，作者从这些患者（GSE161801）中有配对免疫细胞的多发性骨髓瘤（RRMM）患者中提取了骨髓瘤细胞，并分析了本研究数据集中识别的特征。结果显示，骨髓瘤细胞的免疫反应激活特征与CD8⁺细胞毒性T细胞（T_CD8_tox）的共刺激评分、NK^dim、CD8⁺效应记忆T细胞和γδT（gdT）细胞的细胞毒性评分呈正相关；相反，肿瘤细胞中呈负相关。这些数据表明，肿瘤中免疫激活的早期减少持续到复发阶段，而CD8⁺效应T、NK和γδT细胞在免疫排斥肿瘤微环境（TME）中的功能受损有助于骨髓瘤细胞的免疫逃逸（图5）。

7、YBX1参与了MM的免疫应答、免疫细胞浸润和临床结果

鉴定了一个转录因子YBX1（Y-box结合蛋白-1，YB-1），该TF在低免疫反应状态的骨髓瘤细胞中上调，与MHC I类分子的表达呈负相关，而与免疫抑制基因LGALS1和TGFB1的表达呈正相关，这些都表明YBX1可能是调节免疫反应程序的一个潜在因素。与非常好的部分缓解（VGPR/PR）患者相比，稳定疾病（SD）患者在基线和2个治疗周期中的肿瘤中均有YBX1表达上调。分析来自GSE161195数据集中原发性难治性MM（PRMM）的患者，验证了YBX1高表达与低药物反应之间的相关性。生存分析结果显示YBX1的高表达显著预示了MM患者较差的OS和无进展生存期（PFS）。同样，对CoMMpass队列进行了GSEA分析结果显示，与低YBX1组相比，MM高表达YBX1组的造血干细胞分化、mTORC1信号通路、MYC靶点、细胞周期等多种生物学过程均上调。相比之下，YBX1高表达组中涉及免疫应答激活的通路被下调。通过对CoMMpass队列进行ssGSEA分析发现，与YBX1高表达的患者相比，CD4⁺/CD8⁺记忆T细胞，γδT，NK，多个髓系亚群和B细胞在YBX1低表达的患者中明显降低。

为了验证本研究中scRNA-seq数据中关于YBX1在MM中的功能的结果，作者进一步对人骨髓瘤细胞系（HMCLs）和原发性骨髓瘤样本进行了体外实验。敲除YBX1后，U266、OPM2和RPMI-8226的细胞增殖显著下降。同样，在抑制YBX1后，原发性骨髓瘤细胞的细胞活力下降。通过体外共同培养发现了降低YBX1的表达使T细胞和骨髓瘤细胞相互总用增强。这些结果重现并验证了本研究在scRNA-seq分析中观察到的基因表达模式，并表明YBX1通过去除T细胞功能和促进免疫抑制来促进其对骨髓瘤生存和药物反应的影响（图6）。

三、小结

本研究使用scRNA-seq揭示了MM的异质性恶性肿瘤和微环境变化，并基于治疗前和治疗后的动态分析识别了特异性转录组，MM在治疗过程中的分子和细胞复杂性，并为药物反应和治疗选择提供了潜在的分子生物标志物。本研究有4个亮点：1、作者对患者治疗前和治疗后的样本进行单细胞测序研究，很好地比较了每个细胞簇治疗前后差异基因的功能特征。2、当作者发现MM和浆细胞高度相关时，通过对浆细胞簇的重新聚类以及使用CNA区分患者中正常的浆细胞和非正常浆细胞。3、应用免疫评分量化免疫微环境并确定了低免疫评分和免疫逃逸相关。4、最后，作者通过体外培养确定了YBX1通过去除T细胞功能和促进免疫抑制来促进其对骨髓瘤生存和药物反应的影响。

参考文献：Chen M, Wan Y, Li X, Xiang J, Chen X, Jiang J, Han X, Zhong L, Xiao F, Liu J, Huang H, Li H, Liu J, Hou J. Dynamic single-cell RNA-seq analysis reveals distinct tumor program associated with microenvironmental remodeling and drug sensitivity in multiple myeloma. Cell Biosci. 2023 Jan 30;13（1）:19. doi: 10.1186/s13578-023-00971-2 . PMID: 36717896 ; PMCID: PMC9887807 .