单细胞免疫微环境如何发30+？

大家新年快乐呀！今天小编给大家带来一篇23年1月份刚刚发表在GUT杂志（IF：31.793）上的文章“Distinct single- cell immune ecosystems distinguish true and de novo HBV- related hepatocellular carcinoma recurrences”。文章主要研究了不同复发肝细胞癌的单细胞免疫生态系统。

背景

肝细胞癌是一种世界范围内常见的癌症，其5年生存率仅为18%。切除后的高复发率(5年内高达70%)是肝细胞癌（HCC）长期生存的重要障碍。更好地了解复发性肝癌的肿瘤免疫微环境(TIME)对于在这种侵袭性疾病的早期阶段治疗至关重要。

肝细胞癌患者可能会经历真正的肿瘤复发(由原发肿瘤扩散引起，治疗后<2年)或新发癌症(从受损的肝实质新生，治疗后>2年)。然而，复发与新发TIME的特征仍不清楚。对两种类型的复发肝癌的免疫生态系统进行解剖，可以对这两种肝癌之间免疫逃逸机制的异质性提供新的见解。

作者收集了20例初治复发性肝癌患者的23例肿瘤标本和11例配对的癌旁肝组织(NAT)，表征了两种不同类型的复发肝癌的基因组图谱和TIME，进一步解析复发肝癌的免疫微环境，及其免疫逃逸的机制。包括全外显子组测序(WES)、scRNA-seq、Bulk RNA-seq、多重免疫荧光(IF)、流式细胞术和体外功能分析。

结果解读

新发肝癌通常早于治疗后两年

使用患者的肿瘤和NAT样本进行了WES。根据对原发和复发肿瘤样本的突变分析和系统发育分析，确定了两种复发类型(图2C，D)。新发肝癌在临床上被定义为切除后2年以上的复发。然而，这项研究中，12例新发的肝癌中有8例在2年内发生并在两个验证队列中都得到了证实(图2E)。两年内的复发可能是由于原发癌细胞扩散到肝实质，在相当一部分病例中也可能是新生肿瘤。

复发可能发生在原发性肝细胞癌检测之前

考虑到早期扩散的可能性，作者构建了一个模型来追踪肝内转移的动力学。首先，对原发和复发肿瘤的突变进行了癌细胞分数(CCF)分析，以确定转移模式。CCF分析显示了两种类型的克隆性转移(图3A)。

应用SCIMET模型进一步推断这些配对样本的转移时间。SCIMET算法假设转移最初是由单个细胞播种的。从SCIMET模型推测的进化模式表明，PT01、PT15和PT16的复发肿瘤经历了严格的亚克隆选择。相比之下，PT05、PT11和PT14的复发肿瘤倾向于在中性情况下发展(图3B)。SCIMET模型显示在这些患者中有较高的患者特异性突变率(u)。基于在配对肿瘤样本中看到的体细胞突变的数量，进一步量化了当癌细胞开始扩散到肝脏其他区域(ND)时的原发肿瘤大小。这个时间点被定义为传播的时间。此外，3/6例为远处肝内复发(PT05、PT14、PT15)，提示肿瘤早期向原发灶远处扩散。在验证队列中证实了这一发现(图3C，D)。在所有病例中，据估计，当原发肿瘤体积小于1cm³时，早期扩散就已经形成。总之，这些数据表明，即使在完全切除原发肿瘤的情况下，从原发肝癌早期种植也可能导致快速复发(图3E)。

scRNA-seq分析两种复发肝癌的TIME

对23例复发的肿瘤样本和11例NAT样本进行了scRNA-seq分析。经过质量控制和筛选，获得了317558个高质量细胞。聚类为4个主要簇和43个细胞亚型(图4A,B)。免疫细胞包括T细胞/固有淋巴样细胞、髓系细胞、中性粒细胞、浆细胞样树突状细胞(PDCs)、B细胞、浆细胞和肥大细胞；非免疫细胞的大部分为恶性细胞(图4A，B)。

复发与新发肝癌患者DC比例的差异

髓系细胞可重新聚为13个簇，包括7个巨噬细胞簇，3个DC簇，2个单核细胞簇和1个周期细胞簇（图4D）。所有髓系细胞亚型中，只有DC2和mregDC在新发肿瘤中的比例略高于复发肝癌，DC1的比例相似。流式细胞术显示在新发肿瘤中mregDC的比例显著高于复发的肿瘤，新发肿瘤中DC1和DC2的比例有增加的趋势(图4F)。与复发的肿瘤相比，所有DC亚型(DC1、DC2和mregDC)在新发肿瘤中表现出更多的抗原处理和提呈、共刺激特征和分化特征(图4G)。总的来说，这些数据显示除DC外，其他的髓系细胞特征大致相似，在复发的肝细胞癌中，DC的比例和功能都降低了。

复发与新发肝癌患者淋巴细胞比例的差异

淋巴细胞亚群鉴定出19个簇，包括6个CD8⁺T细胞簇、2个NK细胞簇、5个ILC簇、2个CD4⁺T细胞簇、1个调节性T细胞(Treg)、naïve T细胞(Tn)、T_MALAT1细胞和周期T细胞(图5A)。在复发肝癌中，CD4⁺T细胞的比例低于新发肝癌。CD8⁺T细胞的比例呈现相反的趋势图5B，C)。

使用基于TCR的方法来识别和表征肿瘤特异性T细胞，将T细胞分为肿瘤特异性T细胞和肿瘤无关T细胞，发现肿瘤特异性CD4⁺T和CD8⁺T细胞的克隆大小明显大于肿瘤无关的CD4⁺T和CD8⁺T细胞，肿瘤特异性T细胞的克隆多样性低于与肿瘤无关的T细胞(图5D)。

通过比较两种复发类型的肿瘤特异性和肿瘤无关T细胞，发现复发与新发肝癌相比，肿瘤特异性CD8⁺T细胞的丰度增加。相反，新发肿瘤中与肿瘤无关的CD4⁺T细胞比例增加(图5E，F)。

复发肝癌患者中肿瘤特异性CD8⁺T细胞亚型的变化

之后作者聚焦于肿瘤特异性CD8⁺T细胞。重新聚类检测到5种肿瘤特异性CD8⁺T细胞亚型。CD8_Tem_GZMK_KLRB1和CD8_Tem_GZMK_CD27细胞在复发肿瘤中较丰富，CD8_Tex和CD8_Teff细胞在新发肝癌中较丰富(图5H)。并使用流式细胞术分析得到了证实(图5J)。

已有报道表明CD8⁺CD161⁺T细胞的细胞毒性作用减弱。因此用流式细胞术检测了复发肝癌组织中CD8⁺CD161⁺T细胞和CD8⁺CD161^-T细胞GZMB和IFN-γ的表达水平，证实CD8⁺CD161⁺T细胞具有较低的细胞毒活性(图5L)。D8⁺CD161⁺T细胞可能处于弱细胞毒性和免疫抑制表型的记忆状态。此外，结果还强调了复发和新发肝癌在TIMEs方面的其他差异，即新发肿瘤中CD8⁺T细胞丰度降低。

肿瘤特异性CD8⁺T细胞在新发肝癌中处于细胞毒性但耗竭状态，在复发肝癌中处于低细胞毒性状态

接着作者研究了肿瘤特异性CD8⁺T细胞的转录状态和动态细胞转变。首先，CD8⁺T细胞在新发的肝癌中上调CTLA4、CXCL13，提示一种耗竭和细胞毒性的T细胞表型。CD8⁺T细胞在复发肝癌中上调XCL1、EBES，表明为静息记忆T细胞表型(图6A，B)。此外，新发肝癌CD8⁺T细胞中的细胞毒性特征比复发样本中的细胞毒性特征略有增加（图6D）。

为了进一步证实两种复发肝细胞癌中肿瘤特异性CD8⁺T细胞的不同免疫状态，使用Monocle方法推断了状态轨迹。由于肿瘤特异性CD8⁺T细胞中没有naïve细胞，伪时序分析是从CD8_Teff细胞开始，通过以CD8_Tem_GZMK_CD27细胞为特征的中间效应记忆状态，最终达到两个终末状态，一个是CD8_Tex细胞，另一个是CD8_Tem_GZMK_CD161细胞(图6E)。在此过渡期间，细胞毒性分数减少，而耗竭分数增加(图6F)。

不同复发类型中肿瘤特异性CD8⁺T细胞激活状态和差异基因表达模式

接下来，分别研究了CD8⁺T细胞在复发和新发肝癌样本中的轨迹。毒性CD8⁺T细胞主要出现在新发的肿瘤中，CD8_Tem_GZMK_CD161细胞主要出现在复发的肝癌中(图6G)。新发肝癌中，CD8_Tem_GZMK_CD27细胞更可能向耗竭的CD8⁺T细胞状态转变。复发肿瘤样本中，CD8_Tem_GZMK_CD27细胞显示了两种不同的路径，一种过渡到衰竭状态，另一种过渡到细胞毒性较弱的记忆状态(图5G)。

根据上述两条轨迹路径的分支点，将CD8⁺T细胞分为三个阶段：分支前阶段、Fate 1期、Fate 2期。分枝前阶段的T细胞表达高水平的GZMB、GZMH、NKG7、PRF1 (图6H)。Fate 1期，细胞高表达经典检查点基因和耗竭相关基因。Fate 1期富集在TCR信号通路和PD-1信号通路。CD8_Tem_GZMK_CD161细胞聚集在Fate 2期，与记忆表型一致，细胞毒性较弱。Fate 2期富集在免疫调节和FCGR3A介导的IL10合成（IL10可抑制CD8⁺T细胞GZMB或IFN的表达，抑制其活化和抗肿瘤功能），进一步证实了Fate 2期细胞毒性较弱。

在新发肝癌样本中，CD8⁺T细胞主要驻留在分支前阶段，并在Fate 1阶段耗竭(图6I，J)。相反，在复发肝癌样本中，CD8⁺T细胞主要存在于Fate 2期，部分处于耗竭阶段，这表明除了向衰竭过渡之外，CD8_Tem_GZMK_CD27细胞有一个独特的发育程序，从CD8_Tem_GZMK_CD27细胞到相对静止的记忆表型(图6J)。

总之，对复发和新发肝癌样本中CD8⁺T细胞分析显示，在过渡轨迹中，CD8⁺T细胞处于不同的免疫和转录状态。新发肿瘤样本中CD8⁺T细胞具有细胞毒性和耗竭表型的特点。相反，复发的肝细胞癌样本中，CD8⁺T细胞富含细胞毒性较弱的记忆T细胞。

两种类型的复发肝癌的免疫抑制模式不同

细胞间相互作用发现，新发肝癌中与肿瘤特异性CD8⁺T细胞的耗竭呈正相关的前两种免疫细胞亚型是巨噬细胞和mregDC(图7A)。这些髓系细胞通过LGALS9与CD8⁺T细胞密切相互作用，并且在新发肝癌中作用更强(图7B)。此外，LGALS9在新发肝癌的髓系细胞中的表达更高(图7C)。多重IF还表明Galectin9⁺CD68⁺髓系细胞在TIM3⁺CD8⁺T细胞附近(图7D)。这提示髓系细胞在肝癌复发时通过LGALS9和PD-L1轴耗尽CD8⁺T细胞的过程中起着重要作用。

同时作者检查了复发肝癌TIEME内的细胞-细胞相互作用。由于Treg、巨噬细胞和其他免疫抑制细胞在两种类型的复发中的比例相似，假设恶性细胞的差异是复发肝癌发生免疫抑制的原因。因此，首先确定了两种复发肝癌之间的恶性细胞功能差异。在复发肿瘤中，肝癌细胞中免疫相关途径如TNFα信号通路、IFN_Υ反应和IFN_α反应等均有丰富表达。相反，新发肿瘤的基因上调是与代谢相关的途径，包括氧化-磷酸化和胆固醇稳态(图7E)。复发的肿瘤有更高的‘免疫逃逸’特征表达，而新发肿瘤表现出更高的‘氧化-磷酸化’特征表达(图7F)。这些数据表明，在复发肝癌中，恶性细胞表型可能直接介导免疫逃逸。

免疫抑制检查点GDF15在复发肝癌中上调

免疫检查点基因在肝癌细胞中的表达水平较低。因此，对这两种复发类型恶性细胞的差异表达分析发现GDF15在复发肝癌中显著上调(图7G、H)。肝癌细胞和树突状细胞之间的相互作用已知会影响效应T细胞的抗原呈递。恶性细胞和DC之间通过GDF15/TGFBR2、GDF15/CD48或GDF15/CD44的相互作用只发生在复发肝癌中(图7I，J)。

体外功能实验结果发现，在DC的抗原呈递过程中，CD40、CD80和CD86这三种共刺激分子的蛋白水平在GDF15处理组显著下调，这种作用可以通过使用抗GDF15中和抗体部分恢复(图8A-C)。同样，GDF15治疗组的GZMB⁺CD8⁺T细胞比例显著降低，相反，抗GDF15中和抗体增加了GZMB⁺CD8⁺T细胞的比例(图8D)。这些发现表明，GDF15可以抑制DC的抗原提呈和CD8⁺T细胞的细胞毒性，与GDF15的影响一致，在复发肝癌中，肿瘤特异性CD8⁺T细胞与DC之间的相互作用比新发肝癌少(图8E)。

最后，作者评估了GDF15在肝癌细胞中的表达对预后的价值。GDF15的高表达与验证队列1中的肝癌患者的无复发生存期显著缩短有关(图8F)。综上所述，GDF15⁺恶性细胞与DC的相互作用抑制了肿瘤相关抗原（TAA）的提呈，阻碍了T细胞的激活，并与复发肝癌预后不良有关。

抗PD-1治疗可能更有效地对抗新发肝癌

新发和复发肝癌免疫抑制的不同模式(图8G)强调了不同免疫治疗策略的必要性。抗PD-1治疗可能是新发肝癌更为合理的治疗方案。作者检查了正在进行的前瞻性第二阶段临床试验的早期临床数据，该试验正在测试新辅助抗PD-1免疫疗法对初步治疗后复发的肝癌患者的疗效。在这项试验中，在11名入选患者中，两名肝癌患者有反应(一名完全，一名部分)。但是，这两个应答者的复发肿瘤被归类为新发肝癌，而那些无应答者是复发肝癌。抗PD-1免疫治疗对新发肝癌患者的反应与这种复发时T细胞的细胞毒性和耗尽的表型以及DC的相对正常功能是一致的。

相比之下，在复发肝癌中，抗PD1治疗可能不能有效地诱导T细胞对肿瘤特异性的细胞溶解攻击，因为它们处于静止状态，没有肿瘤抗原的有效刺激。DC的抗原提呈功能受损和GDF15在复发肝癌细胞上的表达支持这一结论。

总结

作者使用全外显子组测序分析成对的原发和复发的肝癌样本的突变特征和进化轨迹，确定了新发肝癌与复发肝癌，并分别刻画了复发与新发肝癌的TIME。复发肝癌TIME的特点是KLRB1⁺CD8⁺T细胞增加，具有记忆表型和低细胞毒性。相反，细胞毒性和耗竭的CD8⁺T细胞在新发肝癌中有丰富的表达。转录和相互作用分析显示，GDF15在靠近树突状细胞的肝癌细胞上表达增加，这可能抑制了抗原提呈，并抑制了复发肝癌的抗肿瘤免疫。相反，髓系细胞与T细胞的相互作用导致了肝癌复发时T细胞的耗竭和免疫抑制。新辅助抗PD-1免疫治疗的第二阶段试验显示，在新发肝癌患者中有更多的反应。