免疫治疗在抗肿瘤的方案中具有巨大的潜力。目前，主要在临床应用的方案还是以靶向PD-1/PD-L1的免疫药物。然而，一系列的临床实验观察到的临床预后远远达不到预期。这个问题引起各个肿瘤领域的专家争相发表自己的看法。今天，我们来听听代谢组学对肿瘤的免疫治疗有哪些见解吧。

首先，以一篇发表在《Cancer Cell》的文章来介绍今天的主题：“Lactic acid promotes PD-1 expression in regulatory T cells in highly glycolytic tumor microenvironments” ，乳酸促进高水平糖酵解的肿瘤微环境 (TME) 中调节性T细胞的PD-1表达

要素解读：

Treg：可分为天然产生的自然调节性T细胞（n T-regs）和诱导产生的适应性调节性T细胞(a T-regs或i T-regs)，如Th3、Tr1等，其中Tr1细胞分泌IL-10；Th3细胞分泌TGF-β。肿瘤研究主要指CD+4 CD+25 Treg，CD+4 CD+25 Treg约占外周血及脾脏CD+4 T细胞的5%～10%，CD+4 CD+25 Treg除表达CD4分子和CD25分子外，其特征标志为高表达转录因子Foxp3。Foxp3不仅能作为CD+4 CD+25 Treg的标志分子，还是决定CD+4 CD+25 Treg功能的关键基因。

肿瘤代谢重编程：代谢重编程作为癌症的特征之一，赋予了癌细胞在营养缺乏的肿瘤微环境（TME）中生长和增殖的潜能。正常细胞通常利用氧化磷酸化（OXPHOS）获取营养。而Warburg发现，在乏氧的环境中，肿瘤细胞会通过消耗葡萄糖产生乳酸的方式获取营养。

科学问题：

尽管众所周知，合成代谢和氧化还原稳态是癌症生长的关键，但仍需要澄清是否特定机制或因素驱动了这些代谢适应性以及这些适应性是否可以靶向抑制癌症。在肿瘤代谢环境中，免疫细胞的免疫状态的改变，是否达到足以引起免疫抑制或成为免疫治疗的仍是亟待回答的问题。

文章摘要：

本研究表明，在高糖酵解性肿瘤(如MYC扩增的肿瘤、肝脏肿瘤)中，Treg细胞比效应T细胞获得更高的PD-1表达。在肿瘤细胞消耗低葡萄糖的环境下，Treg通过单羧酸转运蛋白1 (MCT1)积极吸收乳酸(LA)，促进活化T细胞核因子（NFAT1）转位到细胞核，从而增强PD-1的表达，而效应T细胞的PD-1表达被抑制。PD-1阻断激活表达PD-1的Treg细胞，导致治疗失败。我们提出，在高度糖酵解的TME中，LA通过上调PD-1表达，是Treg细胞在TME中功能的一个活跃检查点。

结果展示：

Glycolytic activity of tumors is associated with PD-1 expression by eTreg cells in the TME

肿瘤的糖酵解活性与TME中eTreg细胞表达PD-1有关

Treg细胞通常被认为主要表达FOXP3。作者调研文献发现：CD4 + T细胞被刺激后也会上调FOXP3，短暂表达FOXP3的活化CD4 + T细胞可能会污染Treg细胞[1]。因此，作者根据CD45RA和FOXP3对Treg细胞进行了分类: naive Treg细胞(CD45RA + CD25 low FOXP3 low CD4 +) (I); eTreg细胞(CD45RA CD25 high FOXP3 high CD4 +) (II); 非treg细胞(CD45RA CD25 low FOXP3 low CD4 +) (III)。

胃癌(GC)和非小细胞肺癌(NSCLC)样本的测序数据纳入该研究, 区分肿瘤微环境中高表达PD-1的eTreg (PD-1 high eTreg)与低表达PD-1的eTreg细胞 (PD-1 low eTreg细胞) （图 1A）。

作者通过GSEA分析发现：在PD-1 low eTreg的GC和NSCLC肿瘤组织中，糖酵解相关基因集和MYC基因集显著富集(图1B)。

在PD-1 high eTreg的肿瘤中, LDHA和MYC的表达高于PD-1 low eTreg的肿瘤组织(图1C)。在作者的测序队列中，MYC表达与糖酵解信号显著相关，与既往文献报道一致：MYC是糖酵解的调控因子[2]。作者在MYC过表达(MYC high)的GCs和NSCLC中分析了CD8 + T细胞与eTreg细胞的比例，发现CD8 + T的PD-1水平明显低于MYC低表达的GCs和NSCLC (图1D和1E)。相比之下，MYC high GCs和NSCLC中eTreg细胞的PD-1表达明显高于MYC low GCs和NSCLC (图1E)。

基于此，作者推测在高糖酵解肿瘤中，eTreg细胞的PD-1表达可能上调。前有文献报道，肝转移病灶的糖酵解是通过缺氧促进的[3]。配对的NSCLC原发病灶和肝转移病灶标本进行免疫组化(IHC)。与原发病灶相比，肝转移病灶中糖酵解相关蛋白LDHA、PDK1和HIF1a的表达显著增高(图1F)。FOXP3 + CD4 + T细胞在肝转移病灶中的PD-1表达也明显高于原发病灶，而CD8 + T的PD-1表达降低(图1G、1H)。

LA enhances PD-1 expression by eTreg cells, but not by CD8 + T cells, through MCT1

LA通过MCT1增强eTreg的PD-1表达，而不是CD8 + T细胞的PD-1表达

作者下面探索了eTreg细胞在高糖酵解肿瘤中获得更高PD-1表达的机制。在NSCLC样本中，区分出四种T细胞亚群，PD-1 ⁺或PD-1 ^-CD8 + T和PD-1 ⁺或PD-1 ^-eTreg (图2A)。作者对四个T细胞亚群的基因表达进行富集分析，以确定与PD-1表达呈正相关的基因，特别是在eTreg中，而不是在CD8 + T中(图2B)。在PD-1 + eTreg富集基因中高表达的基因，作者关注到编码MTC1的SlC16A1基因(图2C)。考虑到LA是肿瘤糖酵解的最终产物，作者研究了通过MCT1摄取LA是否可以诱导eTreg细胞表达PD-1。事实上，在PD-1 high eTreg的GC样本中LA含量明显高于PD-1 low eTreg的样本(图2D)。

流式细胞术检测每个T细胞亚群的MTC1蛋白的表达情况。与LA代谢有关的MCT1和 LDHB[4], 在TME中PD-1 + eTre显著增加,而在PD-1 + CD8 + T显著表达下降(图2 E,F)。细胞表面MCT1的表达与CD147的紧密相关[5]。流式细胞术分析了晚期GC样本和小鼠肿瘤模型的肿瘤浸润淋巴细胞。结果显示，与CD8 + T相比，eTreg的MCT1、CD147和LDHB蛋白表达明显更高(图2G、2H)。作者的WB结果也证实了MCT1和LDHB的高表达。利用公共数据集中的染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)数据进行分析发现SLC16A1和BSG(编码CD147)基因都含有FOXP3结合位点。在FOXP3过表达的Jurkat细胞中，MCT1和CD147的表达明显高于对照Jurkat细胞。以上结果提示FOXP3可直接促进eTreg中MCT1和CD147的表达。

接着，作者分析了LA和PD-1在每个T细胞亚群中的表达之间的联系，特别是eTreg。在低糖条件下，用抗CD3和CD28单克隆抗体 (mAbs) 体外刺激CD8 + T细胞和eTreg细胞，增加LA浓度。随着LA浓度的增加，eTreg细胞的PD-1表达明显升高。相反，PD-1在CD8 + T细胞中的表达与LA浓度成比例下降(图2I和2J)。有文献报道，当Treg通过MCT1从TME中吸收LA时，LA在Treg细胞中代谢为磷酸烯醇丙酮酸(PEP)。PEP被称为代谢免疫检查点，可以激活T细胞功能。PEP可增加细胞质钙离子(CA^{2 +})浓度，促进NFAT1转位到细胞核内。作者通过实验发现，当在低糖条件下刺激CD8 + T细胞时，LA浓度的增加导致Treg细胞中PEP含量、CA^{2 +}含量和核内NFAT1表达的显著升高，而这些在CD8 + T细胞中没有升高(图2K、2L)。接下来，作者评估了LA浓度对CD8 + T细胞和Treg在低糖环境增殖和凋亡的影响。从PBMCs中分选出CD8 + T细胞和CD45RA^-CD25high (eTreg)，单独培养。在低糖条件下，与CD8 + T细胞相比，eTreg细胞增殖旺盛，凋亡减少。此外，在低LA或高LA环境中进行T细胞抑制实验。用羧基荧光素双乙酸丁二酰亚胺酯标记CD8 + T细胞与CD45RA^- CD25 high CD4 + T细胞 (eTreg)。eTreg细胞在高LA(低糖)浓度时更具抑制作用(图3A)。

NFAT1正向调控多种免疫分子的表达，包括PD-1。为了直接探讨每个T细胞亚群的PD-1表达与MCT1之间的关系，作者对具有药理抑制作用的人T细胞中分析MCT1的作用。来自健康个体的CD8 + T细胞和eTreg在低糖和高LA(15 mM)条件下使用MCT1抑制剂(AR-C155858, MCT1i)处理。结果发现eTreg的PD-1表达以浓度依赖性方式显著降低，而MCT1i略微增加了CD8 + T细胞的PD-1表达。此外，MCT1i处理降低了eTreg细胞的增殖和抑制活性，并增强了细胞凋亡，但在高LA条件下的CD8 + T细胞中没有发挥作用 (图 3D)。作者还在基因敲除鼠中证实了这一结果。用抗CD3和CD28单克隆抗体在低糖和高LA(15 mM)条件下刺激CD8 + T细胞和敲除SlC16A1小鼠淋巴结中的Treg，CD8 + T细胞表达PD- 1显著高于野生型小鼠。与之形成鲜明对比的是，基因敲除SlC16A1可显著抑制Treg细胞的PD-1表达。接下来，作者研究了MCT1表达与高LA条件下Treg抑制活性之间的相关性。低水平的葡萄糖和高葡萄糖条件下，基因敲除Treg细胞中SlC16A1可降低免疫抑制活性，但在低葡萄糖(正常葡萄糖)条件下不会(Figure 3B, C)。综上所述，在低糖高LA环境下，eTreg通过FOXP3控制的MCT1摄取LA，从而上调PD-1的表达，而CD8 + T细胞的PD-1表达呈相反趋势。

PD-1 blockade enhances immunosuppressive activities of eTreg cells in a high-LA environment 

PD-1阻断增强eTreg在高LA环境中的免疫抑制活性

作者研究了PD-1阻断是否可以增强低糖高LA条件下eTreg的抑制功能。高浓度的LA逐渐减少PD-1阻断CD8 + T细胞中IFN-g的产生。相比之下，使用更高浓度的LA处理抗PD-1单克隆抗体可以增强eTreg的抑制活性。抑制试验在低LA或高LA条件下进行。通过添加抗PD -1单抗，效应T细胞(Tresp细胞)在低LA环境中增殖增加，而在高LA环境中不增加(图3E和3F)。当Tresp细胞与eTreg在低LA环境中共培养时，Tresp细胞优先被anti-PD-1单克隆抗体激活，而eTreg受抑制程度略次(图3E)。相比之下，当Tresp细胞与eTreg在高LA环境中共培养时，eTreg细胞的抑制活性增强，PD-1阻断使Trep细胞的增殖显著下降，表明PD-1 + eTreg优先激活(图3F)。因此, 在低糖-高-LA环境下, PD-1封闭可以增强eTreg的抑制效应对于CD8 + T细胞来说,高-LA诱导的PD-1 high eTreg细胞可能与抗PD-1治疗无效有关。

MYC expression regulates the balance of PD-1 expression by T cell populations by governing glycolytic activities and creating a high-LA TME

MYC的表达通过调控糖酵解活性和产生高LA TME来调节T细胞群PD-1表达的平衡

作者在自己的临床样本观察到MYC高表达 (图1D和1E)，所以进行了下面的分析：使用动物模型来评估TME中肿瘤组织中MYC表达对T细胞PD-1表达的影响。作者建立了过表达MYC的MC-38(细胞系:MC-38 ^Myc)和B16-OVA(鼠黑色素瘤细胞系:B16-OVA MYC)(图4A)。

糖酵解的关键调控因子hexokinase 2和LDHA在MYC过表达细胞系中的表达高于mock细胞系(MC-38 mock和B16- OVA mock) (图4A和4B)。因此，与mock细胞系相比，过表达MYC的细胞系在体外和体内产生的LA含量显著增加(图4C和4D)。MC-38 ^Myc肿瘤在免疫受损和免疫正常小鼠中比MC-38 Mock肿瘤生长得更快(图4G)。因此，与MC-38 mock肿瘤相比，MC-38 ^Myc肿瘤中CD8 + T细胞的数量(计数/肿瘤重量)显著降低，尽管Treg的数量是相当的(图4E)。与MC-38 Mock肿瘤相比，MC-38 ^Myc肿瘤中Treg的PD-1表达明显更高，而CD8 + T细胞的PD-1表达在MC-38 ^Myc肿瘤中明显低于MC-38 Mock肿瘤(图4F)。anti-PD-1单抗的抗肿瘤作用在MC-38 ^Myc肿瘤中显著受损(图4G)。在B16-OVA模型中也观察到了类似的结果(图4E、4F和4H)。

Intrahepatic tumors enhance glycolysis and promote PD-1 expression by Treg cells in the TME

肝内肿瘤在TME中增强糖酵解，促进Treg细胞PD-1表达

临床样本数据(图1G和1H)也表明，PD-1在肝转移瘤中主要是由eTreg诱导表达的。将MC-38或B16-OVA细胞接种于C57BL/6小鼠皮下或直接接种于肺或肝。免疫印迹分析显示，胰腺内肿瘤通过激活HIF1α 高表达PDK1和LDHA(图5A,B)。肝内肿瘤组织间质液中LA浓度显著升高(图5C)。与过表达MYC的肿瘤相似，肝内肿瘤中CD8 ⁺ T细胞的数量和PD-1表达明显减少，而Treg的PD-1表达明显增强(图5D、5E)。抗pd -1单抗治疗对肝内肿瘤没有表现出抗肿瘤作用(图5F和5G)，而是激活了肝内肿瘤中的Treg(图5H,I)，并抑制了APCs的成熟。因此，在肝内肿瘤中，PD -1单抗不能增强肿瘤反应性和/或活化的CD8 + T细胞(图5J和5K)。同时，肝内TME中丰富的LA诱导Treg细胞表达PD-1，导致抗PD -1单抗治疗的耐药性。

Resistance of MYC-overexpressing tumors to PD-1 blockade is overcome by inhibiting the LA metabolism of Treg cells

MYC过表达肿瘤对PD-1阻断的耐药性是通过抑制Treg细胞的LA 代谢作用来克服的

作者研究了在TME中靶向肿瘤细胞的LDHA或Treg细胞的MCT1是否可以恢复MC-38 ^Myc瘤中抗PD -1单抗的疗效。作者制备了敲除LDHA-MC-38 ^Myc (MC-38 ^Myc -LDHA RNAi)细胞。基因和药物(GSK2837808A LDHi)抑制肿瘤细胞产生LDHA, 逆转的CD8 + T细胞和Treg细胞表达PD1的平衡，和抑制了Treg细胞的功能,改善了抗PD-1mAbs的功效 (图6 A-H)。此外，MCT1i抑制Treg细胞的MCT1可降低TME中Treg细胞的丰度和PD-1表达，并增加活化的CD8 + T细胞数量，从而导致抗PD-1单克隆抗体显著抑制肿瘤生长(图6I 6P)。因此，MYC过表达肿瘤对PD-1阻断的耐药性可以通过靶向肿瘤中的LDHA或Treg细胞的MCT1来克服。

Efficacy of PD-1 blockade in intrahepatic tumors is recovered by targeting LA metabolism of Treg cells

PD-1阻断对肝内肿瘤的疗效是通过靶向Treg细胞的LA代谢而恢复的

接下来，作者分了在TME中靶向肿瘤细胞的LDHA或Treg细胞的MCT1是否可以增强抗PD-1单抗在肝内肿瘤中的疗效。与过表达MYC肿瘤相似, 在肝内肿瘤，这两个从基因和药物水平抑制了LDHA 表达，降低了LA浓度。逆转T细胞的PD-1表达,抑制Treg细胞的功能,改善了anti-PD-1mAbs (图7 A-H)。此外,抑制肝内肿瘤的Treg表达MCT1，可以降低Treg细胞PD-1表达水平，进而提高了anti-PD-1 mAbs的作用 (图7I-p)。因此，抗PD-1单抗的抗肿瘤作用是通过抑制肿瘤中的LDHA或抑制肝内肿瘤中Treg细胞的MCT1来恢复的。

High expression of glycolysis-related molecules predicts the efficacy of PD-1 blockade in clinical cohorts

在临床队列中，糖酵解相关分子的高表达预测PD-1阻断的有效性

作者继续观察LDHA和MYC表达在PD-1阻断治疗患者中的预测作用。对接受PD-1阻断治疗的GC、NSCLC和恶性黑色素瘤患者进行分析。LDHA或MYC高表达的患者表现为无进展生存期(PFS)较短(图8A,8B)。有MYC扩增的GC患者的PFS明显短于无MYC扩增的GC患者(图8C)。有肝转移的GC和NSCLC患者接受PD-1阻断治疗后，PFS明显短于无肝转移的患者(图8d)。总之，MYC扩增和肝转移、使用免疫检查点抑制剂相关。

总结：

果然是顶刊的生信分析，不仅公共数据库的数据使用的巧妙，基础实验也做的扎扎实实。下面我们来梳理一番：

Step1提出问题-肿瘤的糖酵解水平与TME中eTreg细胞表达PD-1有关

Step2具体化问题-LA通过MCT1增强eTreg的PD-1表达，而不是CD8 + T细胞的PD-1表达

Step3 该问题的临床意义-PD-1阻断增强eTreg在高LA环境中的免疫抑制活性

Step4 明确该问题的潜在机制-MYC的表达通过调控糖酵解水平和产生高LA 来调节T细胞群PD-1表达的平衡

Step5确定肝癌中该问题作用-肝内肿瘤TME中的高水平糖酵解，促进Treg细胞PD-1表达

Step6该机制的临床意义-MYC过表达肿瘤对PD-1阻断的耐药性是通过抑制Treg细胞的LA 代谢作用来克服的

Step7干预该机制的临床意义-PD-1阻断对肝内肿瘤的疗效是通过靶向Treg细胞的LA代谢而恢复的

Step8问题的临床应用-在临床队列中，糖酵解相关分子的高表达预测PD-1阻断的有效性

点题：

作者通过体内体外实验，提出了新的Treg的分子标记物（新分型），验证了eTreg在高乳酸环境中抑制了CD8⁺T的抗肿瘤功能（新表型），最后提出LDHA和MYC是预测免疫治疗的biomarker。看到这里，大家是不是对肿瘤微环境的乳酸代谢很感兴趣呢？其实，生信人团队在过去已经推出相应的专题及文献解析：

21年3月份，我们团队就关注了乳酸主题，解读了一篇范文“Hypoxia-Associated Prognostic Markers and Competing Endogenous RNA Co-Expression Networks in Breast Cancer”。同月，解读了一篇发表在《Nature Communications》的一篇缺氧多组学生信“Muti-omics analysis reveals contextual tumor suppressive and oncogenic gene modules within the actue hypoxic response”。

21年6月份，缺氧联合免疫已经发到了《Briefings in Bioinformatics》，“A new thinking： extended application of genomic selection to screen multiomics data for development of novel hypoxia-immune biomarkers and target therapy of clear cell renal cell carcinoma”.

接着，我们团队在21年7月份推出了乳酸专题，并解读了综述“Lactate modulation of immune responses in inflammatory versus tumour microenvironments”，总结出以下要点：高浓度乳酸形成的pH 6-6.6酸性环境促进肿瘤细胞的转移、血管生成、治疗抵抗；肿瘤微环境中的乳酸能够发挥免疫抑制功能，通过诱导和募集免疫抑制相关细胞和分子，进而促进肿瘤的发展；肿瘤相关巨噬细胞中的组蛋白赖氨酸乳酸化程度高于其他组织中的组蛋白赖氨酸乳酸化。、

22年3月份，我们团队进一步结合了热点-外泌体，解读了关于肿瘤缺氧微环境改变外泌体释放的一篇综述“Exosomes in the hypoxic TME: from release, uptake and biofounctions to clinical applications”。

22年4月，我们团队解读了一篇鉴定与HNSCC患者的预后，纤维化，缺氧，糖酵解相关基因signatures的6+文章。

22年5月，我们团队继续推出的CAFs专题，提到了《基质细胞依赖于“反向沃伯格效应”》，其中 CAFs 主要使用有氧糖酵解作为能量来源，导致乳酸分泌，然后被癌细胞吸收使用OXPHOS产生能量。这些代谢活性和酶催化反应导致内源性活性氧 (ROS) 增加，进而导致耐药性。

那么看到这里，大家是否能察觉肿瘤代谢是一个高分切入点？多组学，免疫细胞亚群，TME浸润非免疫细胞，外泌体，单细胞转录组以及非编码RNA联合分析，更多的肿瘤代谢与肿瘤免疫治疗的潜在的分子机制等待我们的探索呀。

[1] D.Q. Tran, H. Ramsey, and E.M. Shevach, Induction of FOXP3 expression in naive human CD4+FOXP3− T cells by T-cell receptor stimulation is transforming growth factor-β–dependent but does not confer a regulatory phenotype. Blood 110 (2007) 2983-2990.

[2] C.V. Dang, K.A. O’Donnell, K.I. Zeller, T. Nguyen, R.C. Osthus, and F. Li, The c-Myc target gene network. Seminars in Cancer Biology 16 (2006) 253-264.

[3] F. Dupuy, S. Tabariès, S. Andrzejewski, Z. Dong, J. Blagih, Matthew G. Annis, A. Omeroglu, D. Gao, S. Leung, E. Amir, M. Clemons, A. Aguilar-Mahecha, M. Basik, Emma E. Vincent, J. St.-Pierre, Russell G. Jones, and Peter M. Siegel, PDK1-Dependent Metabolic Reprogramming Dictates Metastatic Potential in Breast Cancer. Cell Metabolism 22 (2015) 577-589.

[4] Y.J. Chen, N.G. Mahieu, X. Huang, M. Singh, P.A. Crawford, S.L. Johnson, R.W. Gross, J. Schaefer, and G.J. Patti, Lactate metabolism is associated with mammalian mitochondria. Nature chemical biology 12 (2016) 937-943.

[5] P. Kirk, M.C. Wilson, C. Heddle, M.H. Brown, A.N. Barclay, and A.P. Halestrap, CD147 is tightly associated with lactate transporters MCT1 and MCT4 and facilitates their cell surface expression. Embo j 19 (2000) 3896-904.