Nature重磅 肿瘤微生物促进肿瘤异质性

肿瘤相关微生物群是人类癌症类型肿瘤微环境的内在组成部分。到目前为止，肿瘤内宿主-微生物群研究在很大程度上依赖于bulk组织分析，这掩盖了肿瘤内微生物群的空间分布和局部效应。近期，Nature期刊一篇题为Effect of the intratumoral microbiota on spatial and cellular heterogeneity in cancer的论文揭示了微生物促进癌症进展的作用。

背景

在癌症患者的肿瘤中，恶性细胞被复杂的非恶性细胞环境包围，这些细胞可能具有促瘤或抗癌作用，具体取决于其细胞类型和丰度。体外和临床前动物模型表明，肿瘤相关微生物群中的细菌在癌症发展、转移、免疫监测、和化学耐药性等方面发挥作用。有强有力的分子证据表明，至少33种主要癌症类型存在肿瘤内微生物群，并且肿瘤内微生物群可以是细胞内的。然而，这些微生物的确切身份以及与患者肿瘤细胞或免疫细胞的相互作用尚未完全揭示。此外，肿瘤内微生物群的空间分布和特定的宿主-微生物细胞相互作用是否影响肿瘤微环境在很大程度上是未知的。本文研究了口腔鳞状细胞癌（OSCC）和结直肠癌（CRC）中微生物和宿主细胞在空间水平的相互作用，揭示了肿瘤内微生物群如何促进肿瘤异质性。研究表明被细菌感染的癌细胞以单细胞的形式侵入其周围环境，并将免疫细胞募集到细菌区域。肿瘤内微生物群的分布不是随机的，具有促进癌症进展的免疫和上皮细胞功能。

结果一：肿瘤内微生物群的异质性

作者对11例CRC患者肿瘤的44个组织进行了16S rRNA扩增子测序，观察到门和属水平的肿瘤内微生物群组成在个体患者肿瘤内有所不同。基于β多样性聚类和树状图分析显示，超过三分之一的评估患者具有相对稳定的微生物组组成。然而，大多数患者在肿瘤内微生物组中表现出不同程度的异质性，这表明一部分患者的肿瘤组织中微生物分布不均匀。通过靶向RNA scope-荧光原位杂交成像确认了包括梭杆菌等细菌群落的异质空间分布，在同一肿瘤标本中观察到细菌细胞生物量密集区域/区室和细菌阴性区域，通过定量PCR和微生物组分析验证了RNAscope方法的结果。

为了进一步了解肿瘤内微生物群的空间分布和这些微生物的确切身份，作者通过10x Visium空间转录组学方法应用于CRC标本和OSCC标本。每个捕获的微生物转录本（主要由核糖体RNA组成）两侧都有来自10x Visium捕获点的条形码——寡核苷酸序列，为整个肿瘤组织中的细菌转录本提供空间坐标。此外，来自单个微生物转录本的测序reads包含唯一的分子标识符（UMI），这能够量化这些组织切片中活生物体的细菌转录负荷。使用GATK PathSeq评估所得测序reads在分类学上解析原位测序读取到属水平。在每个组织块内，靶向RNAscope-FISH的连续组织载玻片染色数据证实了这些肿瘤内细菌的空间分布。总体而言，在口腔鳞状细胞和结直肠癌肿瘤内分别有28%和46%的捕获点鉴定出细菌转录本。对于检测到细菌转录本数目统计，每个捕获点鉴定的不同细菌属的数量范围为1至42，在口腔鳞状细胞癌中中位数为8，在CRC肿瘤中为1至31，中位数为2。通过将这种空间转录组学方法应用于肿瘤内微生物群，能够直接识别、量化和空间映射患者组织学完整肿瘤组织中的活细菌，突出了这些肿瘤组织中肿瘤内微生物群相互作用的复杂性。

结果二：肿瘤内生态位的微生物定植

鉴于肿瘤内微生物群在单个肿瘤组织中具有异质性分布，作者试图确定这种空间分布是否与肿瘤微环境内的不同功能相关。通过GeoMx数字空间分析平台量化了与抗肿瘤免疫和癌症进展相关的77种蛋白质的表达谱。实施分段分析以富集感兴趣组织区域的免疫或上皮细胞中提取到的蛋白质数据，这些数据通过RNA scope-显色原位杂交（RNAscope-CISH）注释为细菌阳性或阴性。

在OSCC口腔鳞状细胞癌和CRC肿瘤的CD45免疫细胞富集区域内，细菌存在于高度免疫抑制的微生态位中，其特征在于成熟骨髓细胞富集以及免疫抑制分子ARG1和免疫检查点蛋白CTLA4的上调。此外，在这两种癌症类型中，作者检测到磷酸化ERK1和ERK2水平增加，这表明针对肿瘤内细菌的骨髓反应可能通过激活MAPK信号通路发生。在口腔鳞状细胞癌中，与标本中的细菌阴性区域相比，T细胞抑制受体PD-1在细菌阳性微生态中过表达。这对应于口腔鳞状细胞癌和结直肠癌组织中T细胞标志物（如CD3，CD8，CD4，CD27和CD44）的相对下调，以及增殖标志物KI-67的表达降低，并表明T细胞被排除在这两种胃肠道癌症的细菌定植区域中。

在两种癌症类型的PanCK+上皮肿瘤区域中，细菌定植区域的血管化程度低于细菌阴性区域。此外，作者还观察到平滑肌肌动蛋白（SMA）的表达减少、细胞增殖水平较低。在口腔鳞状细胞癌和CRC肿瘤组织的细菌定植区域中，作者检测到肿瘤抑制因子p53的野生型构型的蛋白质表达显著降低，表明细菌定位与TME内高度转化的癌细胞相关。此外，细菌定植的微生态位显著增加了CRC肿瘤中JNK、ERK1、ERK2以及P38的磷酸化水平，从而揭示了响应细菌而激活的信号通路。RNA scope和免疫组织化学（IHC）技术的结合支持了之前的发现，即PD-1在口腔鳞片标本的细菌阳性微生态位中过表达，此外KI-67水平显着降低，这表明口腔鳞状细胞癌和CRC肿瘤组织的感染区域比未感染区域具有更低的增殖潜力。

结果三：微生物驱动的单细胞异质性

肿瘤微环境中的单个宿主细胞存在于一系列人类癌症类型中。然而，几乎没有关于侵袭细菌的身份的报道。为了研究TME中的细菌-宿主细胞-细胞间相互作用及其对宿主细胞转录组学的影响，作者通过引入靶向细菌16S rRNA保守区域的引物开发了INVADEseq方法，促进了来自细菌相关人类细胞的细菌转录本的cDNA文库的生成，发现肿瘤内菌群以梭杆菌属(34%)和密螺旋体属(29.8%)的细菌种类为主，并通过基因集富集分析(GSEA)证实。随后研究者为了确定与细胞相关优势细菌属是否会影响上皮信号通路。他们将梭杆菌或密螺旋体相关单细胞与上皮细胞群中的细菌阴性细胞进行比较发现在细菌阳性上皮细胞中，与癌症进展相关的基因表达和细胞信号通路受到轻微影响，梭杆菌和密螺旋体主要与这些患者肿瘤中的上皮和单核细胞来源的巨噬细胞-v1（称为巨噬细胞簇）相关。细菌感染的细胞表现出参与细菌感染反应的信号通路的显着上调，例如TNF通路、与炎症和缺氧相关的通路，以及通过上皮-间充质转化（EMT）和p53信号通路影响癌细胞进展。与来自未感染的对照簇的细胞相比，细菌感染的细胞也显示出与有丝分裂纺锤体形成和G2-M DNA损伤检查点相关的细胞周期信号通路的下调。然而，INVADEseq无法区分细菌是否正在主动入侵巨噬细胞还是巨噬细胞是否正在吞噬细菌。总的来说，研究者表明肿瘤内和细胞相关的微生物群可以在免疫和上皮细胞群的单细胞水平上驱动患者肿瘤的异质性。

在巨噬细胞细胞簇中，作者发现吞噬细菌的巨噬细胞通过激活TNF、INFγ和IFNα参与炎症反应的基因，以及通过JAK-STAT信号通路参与白细胞介素产生的基因，如IL1B、IL6和IL10的表达水平显著增加。吞噬细菌的巨噬细胞也过表达趋化因子CCL2、CCL4、CCL8、CCL7、CXCL1和CXCL10。在分析与细菌相关的一般细胞时观察到这种基因表达特征，以及在评估特定细菌属（包括梭杆菌和密螺旋体）时也观察到这种基因表达特征。此外，在标本水平上，每个口腔小细胞标本的细菌载量与强效中性粒细胞化学引诱剂CXCL8呈正相关，与CD3E的表达呈负相关，表明瘤内细菌定植的区域通过募集中性粒细胞和排除CD3+ T细胞，具有免疫抑制作用。

结果四：细菌诱导的癌细胞迁移

为了评估肿瘤内微生物群的主要成员与免疫或上皮癌细胞的直接相互作用，作者使用了共培养等方法发现肿瘤内微生物群在患者肿瘤细菌定植的微生态中对中性粒细胞的富集有积极作用。中性粒细胞募集和保留到感染了具核梭杆菌的癌细胞微环境中，表明肿瘤内微生物群在患者肿瘤的细菌定植微生态位内的中性粒细胞富集中起积极作用。中性粒细胞簇的形成伴随着ERK和p38 MAPK的磷酸化水平显着增加，以响应具核梭杆菌感染。这表明观察到的ERK和p38 MAPK在患者肿瘤内细菌定植微生态位中磷酸化的上调部分是由对肿瘤内细菌的骨髓反应驱动的。作者还观察到感染了具核梭杆菌的CRC上皮细胞会迁移到周围的胶原凝胶中。为了识别相关的信号通路改变，分离含有具核梭杆菌的细胞进行转录组学分析发现暴露于具核梭杆菌导致了参与癌症进展的信号通路的显著上调，与细胞周期和DNA损伤修复等相关的信号通路下调。这些数据表明，源自人类CRC的具核梭杆菌能在细菌感染部位积极诱导骨髓细胞的招募，并促进CRC上皮细胞的转录变化，从而促进对周围环境的入侵。

总结讨论

从历史上看，肿瘤异质性仅归因于克隆扩增过程中癌细胞的内在遗传改变，之前有研究也揭示了来自TME的外在因素在肿瘤发生中起重要作用。已知癌细胞与其他非恶性细胞群（如TME中的成纤维细胞，内皮细胞和免疫细胞）之间的细胞间相互作用通过随着癌症的发展促进转化细胞的转录组变化来促进肿瘤异质性。随着我们对TME的理解不断加深，我们对影响肿瘤异质性的因素的理解也在提高。基于基因组学的研究表明，大多数主要类型的人类癌症都含有肿瘤内微生物群，这些微生物群落因癌症类型而异，特定的细菌可促进癌症的发生和发展，影响患者对治疗的反应，从而影响生存。然而，存在的内在异质性使得难以理解TME不同组成部分之间的相互作用，包括天然组织背景下的细菌-宿主相互作用。空间转录组学和scRNA-seq技术的发展使得TME的真核成分得以研究，但迄今为止，TME中肿瘤内微生物群的作用一直被忽视。在这项研究中，通过调整和应用这些技术，作者得出结论，肿瘤内微生物群在人类肿瘤中异质分布。此外，作者发现它是TME的基本组成部分，可以改变不同细胞的生物学过程，影响抗肿瘤免疫和癌症上皮细胞的迁移。通过激活JUN和FOS家族的转录因子，细胞内细菌可以产生与癌细胞侵袭、转移、DNA损伤修复和细胞休眠一致的基因标记。同样，侵袭细菌负责招募髓系细胞以通过JAK-STAT信号诱导炎症反应，通过将特定的白细胞介素和趋化因子分泌到周围环境中来促进T细胞排斥和肿瘤生长。虽然本文关注的是胃肠道极端的两种癌症类型，但描述的工具和技术可以应用于分析迄今为止已被证明含有肿瘤内微生物群的33种主要癌症类型。总的来说，肿瘤内微生物群在患者肿瘤内的分布不是随机的，而是微生物群在具有支持癌症进展的免疫和上皮细胞功能的微生态位中高度组织。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41586-022-05435-0