大家好，今天给大家分享的是2022年5月发表在Hepatology（IF=17.2）上的文献。非病毒性肝癌的关注率逐渐升高，其肿瘤免疫异质性及其对联合免疫治疗反应的影响尚未明确。本文通过多组学确定了肝癌瘤内脂肪变性和耗竭肿瘤免疫微环境之间的联系。

Multiomics identifies the link between intratumor steatosis and the exhausted tumor immune microenvironment in hepatocellular carcinoma

在肝细胞癌中多组学确定了瘤内脂肪变性和耗竭肿瘤免疫微环境之间的联系

研究背景：肝癌是全球致死率排名第四的癌症。肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的原发性肝癌类型，是一种具有多种病因的异质性疾病。丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）是HCC的主要原因之一，由于监测和治疗不断改善，全球HCV相关HCC（HCV-HCC）的患病率一直在下降。同时，非病毒性HCC的患病率正在迅速增加，其原因多种多样，如酗酒、非酒精性脂肪肝（NAFLDA）和糖尿病（DM）。了解HCC的多样性以开发靶向治疗将需要解开致癌过程的分子机制。在过去20年中，已在遗传和转录组水平上对HCC进行了分析。然而，分子和临床病理学特征之间的关系，特别是在非病毒性HCC患者中，尚未完全确定，除了最近关于NASH-HCC突变特征的一份报告。近年来，免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）在各种实体肿瘤中显示出显著疗效。这些药物包括针对细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）、程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）及其配体PD-L1的单克隆抗体。2020年，IMbrave150试验表明，与索拉非尼相比，使用阿替利珠单抗联合贝伐单抗的抗PD-L1联合抗VEGF疗法显著延长了不可切除HCC患者的无进展生存期（progression-free survival，PFS）和总生存期（overall survival，OS），并且联合免疫疗法目前已成为治疗HCC的焦点。虽然已成为晚期HCC患者的一线疗法，但缓解率约为30%；因此，超过一半的患者不会获得太多益处。这可能是由于HCC患者分子异常和肿瘤免疫微环境（Tumor Immune Microenvironment，TIME）的高度异质性。一般来说，TIME根据肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）水平和免疫检查点表达分为免疫排除、免疫激活和免疫耗竭亚型。一项meta分析表明，TILs水平和PD-1/PD-L1表达与多种癌症类型对ICIs的反应呈正相关。然而，曾有人最近报道，尽管存在高水平的CD8+PD1+T细胞，但由于免疫监测受损，非病毒性HCC，尤其是NASH-HCC对免疫治疗的反应可能较弱，提示NASH-HCC存在独特TIME。然而，非病毒性肝癌的肿瘤免疫异质性及其对联合免疫治疗反应的影响尚未明确。在这项研究中，作者利用基因组和转录组对113名非病毒性HCC患者进行了分子和免疫学分析。这种多组学方法能够根据预后或TIME对非病毒性HCC患者进行分层。作者进一步确定了脂肪变性HCC与免疫富集但免疫耗竭TIME之间的新联系。从机制上讲，作者发现HCC细胞中的脂质积累诱导PD-L1上调并促进共培养的巨噬细胞和成纤维细胞的免疫抑制变化。最后，作者发现通过化学位移MR成像鉴定的脂肪变性HCC患者对使用抗PD-L1和抗VEGF抗体的联合免疫治疗敏感，这表明肝癌中肿瘤内脂肪变性可能是预测免疫治疗疗效的新型成像生物标志物。

数据：RNA-seq数据已保存在GEO中，登录号：GSE190967。

基因组序列数据已保存在JGA中，登录号：JGAS000523和JGAD000642。

空间转录组学数据已保存在JGA中，登录号：JGAS000311。

结果：

1、多组学将非病毒性肝细胞癌分为三个预后亚型

通过肿瘤RNA测序了解非病毒肝细胞癌的分子异常。转录组学无监督聚类分析将113例非病毒性HCC患者分为3类（I、II和III类）（图1A）。I类患者预后最差，而III类患者预后最好（图1B）。GAGE分析中I类显示细胞周期和有丝分裂相关基因集随着FOXM1和AURKB上调而富集，GAGE分析中III类显示免疫细胞激活相关基因耗竭而wnt-β-catenin信号通路基因GLUL、SPARCL1、AXIN2、GREB1上调，树突状细胞向肿瘤细胞迁移相关基因CCL4、CCL5下调。结合之前分子分类研究，I类与Chiang分子分类中的增殖亚型关联。II类与Chiang分类中的IFN亚型和Hoshida分类中的S1亚型相关联。第III类与Chiang分类中CTNNB1亚型和Hoshida分类中的S3亚型相关联（图1A）。接下来，对55名非病毒性HCC患者进行基因组测序，检测到69个基因异常，与前期研究一致。在55个样本中有50个检测到体细胞突变，并且经常在TERT启动子区、CTNNB1和TP53中观察到（图1C）。综合分析显示I类与TP53突变密切相关，III类与CTNNB1突变有关（图1C）。TP53突变的非病毒性HCC预后最差，而CTNNB1突变的非病毒性HCC预后最好（图1D）。

图1 多组学将非病毒性肝细胞癌分为三个预后亚型。（A）非病毒性肝癌的转录组分型。（B）按分子分类的患者Kaplan-Meier分析。（C）55例非病毒性肝癌患者的基因组序列分析。（D）非病毒性肝癌患者基因组异常分层的Kaplan-Meier分析。

2、基于TIME的非病毒性HCC分类

接下来，为了根据TIME对非病毒性HCC进行分类，作者对肿瘤转录本进行了NTP分析，并确定了已报道的以瘤内免疫浸润性较强为特征的免疫细胞亚型。CIBERSORT分析发现113种肿瘤中有43种被归类为免疫亚型，并显示出更高水平瘤内免疫细胞和CTLs（图2A，B）。免疫亚型显示肿瘤内II类显著富集，CTNNB1突变频率明显降低（图2C，D）。CTNNB1突变的非病毒HCCs肿瘤内免疫细胞浸润水平显著降低（图2E）。

图2 基于TIME的非病毒性HCC分类。（A）对肿瘤转录组NTP分析确定了113个肿瘤中的43个为非病毒性肝癌的免疫亚群。（B）免疫组和其他组之间总免疫细胞和细胞毒性T细胞的CIBERSORT评分比较。（C）免疫组和其他组各分子百分率比较。（D）免疫组与其他组CTNNB1或TP53突变百分率比较。（E）有CTNNB1突变与无CTNNB1突变的HCC之间CIBERSORT评分比较。

3、脂肪性HCC表现为免疫富集但免疫耗竭的免疫微环境

前期发现HCC中脂肪变性与免疫亚型密切相关，事实上脂肪性HCC占非病毒性HCC的23%（图3A），它包含更高水平的瘤内免疫细胞（图3B，C）。有趣的是，ssGSEA和通路分析显示，在脂肪变性HCC中，T细胞耗竭信号和基质信号以及TGF-β激活水平显著升高（图3C，D）。脂肪变性HCC还显示出多种与T细胞耗竭有关的免疫检查点和转录因子以及癌相关成纤维细胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）标志物上调（图3E）。此外，CIBERSORT分析显示，脂肪变性HCC中有大量M2巨噬细胞浸润，随之参与巨噬细胞M2极化和免疫抑制的细胞因子和趋化因子也上调（图3C，E）。免疫组化分析证实在GPC3+的HCC细胞中PD-L1表达上调，并发现非病毒性肝癌标本中CAFs和M2巨噬细胞大量浸润（图3G-J）。总的来说，脂肪性HCC呈现免疫富集但免疫耗竭的TIME，其特征是T细胞耗竭、M2巨噬细胞和CAFs浸润、PD-L1高表达和TGF-β信号激活。

图3 （A）脂肪性HCC的代表性图像。T和NT分别代表肿瘤和非肿瘤。（B）脂肪变性和非脂肪变性HCC样本的CIBERSORT总免疫细胞评分比较。（C）113例中26例被确定为脂肪性HCC。免疫得分图显示免疫相关基因富集得分和CIBERSORT得分热图。分子特征图是显示脂肪变性HCC中代表性基因相对表达水平热图。KEGG通路是显示脂肪变性HCC中代表性信号通路富集热图。（D）脂肪性和非脂肪性HCC样本间T细胞耗竭特征、基质特征和TGF-β信号通路富集得分比较。（E）Heatmap显示了抑制性免疫检查点分子（上）、参与T细胞耗竭的转录因子（中）以及CAFs和M2巨噬细胞标志物（下）的代表性基因表达水平。（F）脂肪变性和非脂肪变性HCC标本中M2巨噬细胞CIBERSORT评分比较。（G）PD-L1、αSMA、CD163免疫组化图像。（H-J）PD-L1阳性HCC标本百分比（H）和脂肪性HCC与非脂肪性HCC的αSMA（I）和CD163（J）染色阳性区的比较。

4、耗竭T细胞、M2巨噬细胞和CAFs密切相互作用，构成脂肪性HCC中的免疫耗竭微环境

为了进一步表征脂肪性HCC中免疫耗竭TIME，作者通过Visium平台上的空间转录组学检查了脂肪性HCC中M2巨噬细胞、CAF和CTLs的形貌。将肿瘤切片分为1768个点，从每个点获得转录组数据。首先，基于图形聚类将所有点分成6个簇，簇2免疫细胞群高表达（图4A-C）。ssGSEA显示簇2基质信号和T细胞耗竭信号增强（图4C）。作者提取了CD8A和NR4A1双阳性斑点作为含有耗竭CTLs斑点，发现这些斑点几乎有一半包含簇2（图4D）。然后，作者比较了有或没有耗竭CTLs位点之间的转录组图谱（图4E），发现耗竭CTLs位点中M2巨噬细胞标记物CD163和CAF标记物VIM表达增加，并且TGFB1水平升高（图4F）。这些结果提示，M2巨噬细胞和CAFs可能产生TGF-β并促进周围细胞耗竭，在脂肪变性HCC中形成免疫耗竭微环境。

图4 耗竭T细胞、M2巨噬细胞和CAFs密切相互作用，构成脂肪性HCC中的免疫耗尽微环境。（A）在Visium平台上基于图形的脂肪变性HCC组织空间转录组数据聚类。（B）转录组数据聚类热图。基于图的层次聚类分析将所有点分为6个聚类。（C）每个集群中免疫信号、基质信号和T细胞耗竭信号的富集分数。（D）饼状图显示了每个集群中CD8A阳性和NR4A1阳性的耗尽CTL斑点百分比。（E）剖面图上含有耗竭CTL斑点的位置。（F）小提琴图显示M2巨噬细胞标志物、CAF标志物和TGFB1在耗竭CTL斑点及其他部位的表达水平。

5、棕榈酸（palmitic acid，PA）诱导的肿瘤细胞脂质积累可能促进脂肪变性HCC的免疫抑制

接下来，作者打算探究HCC中肿瘤内脂肪变性与免疫耗竭TIME之间的机制联系。因此，首先进行基于脂质组学的总脂肪酸图谱分析，发现脂肪HCC样本中PA水平明显高于非脂肪HCC组织。因此，作者在体外检查PA积累对HCC细胞的影响。在Hep3B细胞中添加PA可诱导脂质积累（图5A），上调PD-L1表达（图5B，C）以及上调CSF1、CXCL8和TGF-β1表达（图5D，E），所有这些都可以促进M2巨噬细胞极化和/或激活CAFs。PA处理的Hep3B细胞能上调共培养的人巨噬细胞系CD206和IL10的表达（图5F）和共培养的人肝星状细胞系TGFB1的表达（图5G）。这些免疫抑制细胞因子和趋化因子的上调也在脂肪变性HCC体内观察到（图5H）。这些数据表明，PA在肿瘤细胞中积累促进免疫抑制，这可能有助于脂肪性HCC中免疫耗竭TIME的发展。

图5 PA诱导的肿瘤细胞脂质积累可能促进脂肪变性HCC的免疫抑制。（A）加入牛血清白蛋白（BSA）或棕榈酸（PA）24小时后Hep3B细胞的染色图像。（B）添加BSA或PA 24小时后Hep3B细胞中CD274 mRNA表达水平。（C）流式细胞术分析加入BSA或PA 24小时后Hep3B细胞中CD274蛋白表达水平（左）和平均荧光强度（右）。（D）加入BSA或PA 24小时后Hep3B细胞中CSF1、CXCL8和TGFB1的mRNA表达水平。（E）加入BSA或PA 24小时后Hep3B细胞上清中CSF1、CXCL8和TGF-β1蛋白分泌水平。（F）与添加了BSA或PA的Hep3B细胞共培养3天后，巨噬细胞中CD206和IL10 mRNA的表达水平。（G）与添加BSA或PA的Hep3B细胞共培养3天后，LX-2细胞中TGFB1 mRNA的表达水平。（H）脂肪变性和非脂肪变性HCC标本中CD274、CSF1、CXCL8、TGFB1、CD206和IL10 mRNA的表达水平。

6、脂肪变性HCC患者对阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗联合免疫治疗敏感

作者回顾性分析了30名接受阿替利珠单抗联合贝伐单抗治疗的晚期HCC患者。根据化学位移MR，30名患者中有7名被归类为脂肪性HCC（图6A，B）。在5.4个月的观察期间，脂肪性HCC患者均未出现疾病进展。因此，脂肪变性HCC患者PFS明显长于非脂肪变性HCC患者。这些结果表明，脂肪变性HCC患者可能对ICI治疗敏感，而肿瘤内脂肪变性可能是预测ICI治疗HCC疗效的一种新的影像学生物标志物。

图6 脂肪变性HCC患者对阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗联合免疫治疗敏感。（A-B）脂肪性HCC代表性MR和HE图像。（B）肿瘤活检标本HE图像。（C）根据HCC中是否存在脂肪变性进行分层的患者无进展生存期Kaplan-Meier分析。

结论：

总之，多组学分析根据预后或TIME对非病毒性HCC进行分层。作者进一步确定了HCC瘤内脂肪变性与免疫耗竭及免疫治疗易感TIME之间的联系。

参考文献

Murai H, Kodama T, Maesaka K,et al. Multiomics identifies the link between intratumor steatosis and the exhausted tumor immune microenvironment in hepatocellular carcinoma. Hepatology. 2022 May 14. doi: 10.1002/hep.32573. Epub ahead of print. PMID: 35567547.