大家好呀,今天分享的文章题为通过综合分析bulk和scRNA-seq数据识别和验证一种预测肺腺癌预后和免疫治疗的肌肉衰竭指数,于今年一月发表在《Frontiers in Immunology》(IF = 8.786)上,文章有许多创新之处,让我们一起学习一下吧!
一、背景与摘要
肺腺癌(lung adenocarcinoma(LUAD))患者的运动因子的产生与运动的有益作用呈正相关。骨骼肌响应急性和慢性运动时释放运动因子,这些运动衍生分子通过内分泌、旁分泌、自分泌途径参与多系统调节反馈,如葡萄糖维稳、肌肉功能和抗炎反应等。然而,我们对运动介导的基因、运动因子、肿瘤微环境与肿瘤预后之间的关系知之甚少。根据前人的研究结果,有四个基因(BDNF、FNDC5、IL15、MSTN)作为与体育锻炼和骨骼肌密切相关的基因,被发现直接或间接影响肿瘤的发生和预后,我们的研究主要集中在这四个基因上。
本研究提出了一种基于肌肉衰竭相关基因的新评分系统。首先,作者对数据集GSE131907进行单细胞分析,鉴定出了8个细胞亚群,发现在肿瘤细胞中4个肌肉衰竭相关基因显著增加。其中IL15广泛分布于免疫细胞群中。使用LASSO算法创建了基于10个肌肉衰竭相关基因的肌肉衰竭指数(Muscle failure index(MFI))模型,MFI是总生存期(OS)的独立预后因素。在单细胞数据集中计算MFI,其中高MFI的细胞比低MFI的细胞接收和发送更多的信号。两种亚型的生物学功能分析显示,低MFI组具有较强的抗肿瘤免疫活性,而高MFI组的肿瘤细胞具有较强的代谢和增殖活性。最后,作者系统地评估了LUAD患者的免疫细胞活性和免疫治疗反应,发现低MFI组对免疫治疗更为敏感。
二、数据介绍
单细胞转录组数据:GSE131907,共挑选了29个样本(包含正常肺组织、早期、晚期和脑转移癌病例);
TCGA-LUAD患者的转录组RNA测序数据、Mutect2突变数据、Humanmethylation450阵列、拷贝数变异(CNV)数据及相应的临床资料共492个样本。原始FPKM测序数据经TPM归一化后作为训练队列。
从GEO中收集了三个成熟的LUAD队列:GSE30219(Affymetrix HG-U133 Plus 2.0);GSE72094(Rosetta/Merck Human RSTA Custom Affymetrix 2.0),GSE72094(Illumina HumanWG-6 V3.0 Expression Beadchip)。使用SVA包去除批次效应后共使用615个具有完整临床信息的LUAD数据作为验证队列。
具有完整临床信息和转录组数据的免疫治疗队列:298名接受抗PD-L1免疫治疗的晚期尿路上皮癌患者的队列(Imvigor210),以及27名接受PD1治疗的非小细胞肺癌(NSCLC)患者的队列(GSE1352222)。
三、结果
1、LUAD中肌因子基因表达谱的鉴定
本研究主要集中在4个肌因子/运动因子基因(BDNF、FNDC5、IL15、MSTN),在TCGA-LUAD训练集显示这4个基因在肿瘤组织和正常组织中显著差异表达,FNDC5在肿瘤组表达下调,而BDNF、IL15和MSTN在肿瘤中表达上调。作者分析了4个肌因子/运动因子基因的相关性,发现BDNF与其它3个基因没有显著相关,而IL15与FNDC5呈负相关,与MSTN呈正相关;MSTN和FNDC5呈正相关。随后,发现IL15和MSTN是LUAD患者OS的有利因素,而FNDC是LUAD患者OS的不利因素。BDNF对生存率没有显著影响。对单细胞数据集分析注释共鉴定了8个细胞亚群发现这4个基因在肿瘤细胞中明显增加,而且IL15在免疫细胞群中广泛分布(图1)。
2、4个肌因子/运动因子基因的表达与LUAD患者的不良预后和免疫逃逸相关
作者分析四个基因mRNA表达与淋巴结转移、临床分期、ki67阳性的相关性,发现这4个基因的高表达与LUAD患者的肿瘤进展相关。接下来,对4个基因的表达和患者的生存期进行分析,发现IL15和MSTN高表达、FNDC5低表达的患者生存期较长,而BDNF对生存期无显著影响。通过免疫荧光检测了肿瘤组织中PD1和CTLA4的染色强度,并分析了4个基因的mRNA水平与PD1和CTLA4染色荧光强度的相关性。结果显示,BDNF、IL15、MSTN的高表达与PD1和CTLA4的高荧光强度相对应,而FNDC5的表达与PD1和CTLA4的荧光强度呈负相关(图2)。
3、肌肉衰竭指数(MFI)模型的构建与验证
相关性分析确定与4个基因显著相关的共884个肌肉衰竭相关基因。cox回归分析确定了56个具有显著预后疗效的肌肉衰竭相关基因,利用这56个基因构建模型。在所有组合中,发现10个基因的模型是最稳定的,使用MFI来区分高风险和低风险患者,生存分析显示,高危组患者的生存率低于低危组。该模型在1年、3年和5年时的AUC值分别为0.743、0.716和0.67(图3)。
4、评估MFI的预测独立性
首先采用单因素Cox和多因素Cox回归方法分析了癌症患者的风险评分、临床特征与预后之间的关系。两种分析结果都显示MFI是OS的独立预后因素。通过列线图量化LUAD患者的风险评估,结果显示,列线图模型在1年、3年和5年时具有良好的稳定性和准确性。tROC分析表明,与临床特征相比,列线图模型是最好的预测方式。然后作者进一步进行了决策曲线分析(Decision curve analysis(DCA))来评估列线图模型的决策效益,结果表明列线图适用于LUAD患者在1年、3年和5年的风险评估(图4)。
5、单细胞数据中MFI评分
作者对单细胞数据计算MFI评分,结果显示MFI主要分配在特定的恶性细胞组和大多数免疫细胞中。根据MFI将恶性细胞分为高MFI组和低MFI组。通过对细胞进行细胞通讯分析发现,高MFI组的细胞进行细胞互作最多。最后对细胞间通信的特定通路分析,发现与低MFI组相比,高MFI细胞在GDF、VEGF、SEMA3和UGRP1通路中表现出更强的活性,高MFI细胞可能在癌症增殖、代谢和血管生成中更为活跃。(图5)
6、两种亚型生物学功能的差异
通过对高低MFI两组进行差异基因的分析,得到806个基因,其中607个在高MFI组上调,199个在低MFI组上调。功能富集分析显示,高MFI组上调的基因主要调控细胞周期和Gap连锁通路,而低MFI组上调的基因主要调控造血细胞谱系、炎症反应、细胞粘附、B细胞受体、T细胞受体和淋巴细胞迁移。这些结果证实了低MFI组具有较强的抗肿瘤免疫活性,而高MFI组的肿瘤细胞往往具有较强的代谢和增殖活性,这可能是导致两组间预后差异的原因之一(图6)。
7、评估了MFI与免疫浸润之间的相关性
首先,作者从免疫活性方面评估了MFI,结果显示,高MFI组的髓系免疫、PD-L1和IDO1均显著升高,并与MFI呈正相关。相反,除MHC I类和癌旁免疫外,所有免疫通路活性均显著升高,几乎所有免疫检查点均与MFI呈负相关,并在低MFI组中增强。从免疫浸润的角度评估MFI发现高MFI组肿瘤纯度增加,而低MFI组基质细胞和免疫细胞增加。最后,作者分析了与肿瘤特异性抗原相关的4个指标,结果显示,MFI与HRD评分、Indel新抗原与SNV新抗原呈负相关,然而肿瘤内异质性与MFI无显著相关性,提示低MFI组具有更严重的染色体不稳定、更多的肿瘤新抗原和更强的免疫活性,提示该组更有可能从免疫治疗中获益(图7)。
8、MFI与基因组变异的相关性
研究发现,肿瘤突变负荷(TMB)与免疫治疗反应有关,这可能是由于体细胞突变产生的突变来源的抗原增加所致。当免疫系统识别出那些含有突变多肽的抗原时,抗肿瘤免疫就会被激活。考虑到TMB的关键作用,本文探讨了TMB和MFI之间的相关性。作者总结了高MFI组和低MFI组的突变特征,发现MFI与TMB呈负相关,而低MFI组的TMB显著升高。森林图显示了低MFI组中存在突变频率较高的驱动突变基因。评估CNV和MFI之间的关系发现,低MFI组在染色体臂水平上的扩增和缺失频率增加(图8)。
9、低MFI组对免疫治疗更为敏感
IPS可以系统地评估癌症患者的效应免疫细胞活性和免疫治疗反应,发现在TCGA和GEO的队列中,低MFI组的IPS显著升高。同时,TIDE算法预测MFI水平较低的患者可能对免疫治疗有更高的应答率。ROC分析显示MFI比常用的评价指标更具有优势。低MFI组的患者对抗pd1/CTLA-4治疗治疗更为敏感。在一个成熟的免疫治疗队列中构建了MFI,结果显示在高危组中MFI的生存率明显更差。然后作者评估了免疫治疗队列中TMB、新抗原和MFI之间的关系,观察到MFI与TMB和新抗原数量呈负相关,低风险组中TMB和新抗原数量显著较高,这可能导致PD-L1免疫治疗的更好结果。总之,确定了低MFI组对免疫治疗更为敏感(图9)。
四、小结
本文通过对bulk和scRNA-seq数据的系统分析,根据以往的研究报道肺腺癌(LUAD)患者的运动因子的产生与运动的有益作用呈正相关,构建出了和LUAD预后相关的肌肉衰竭指数(MFI)。作者通过筛选和运动因子相关的基因构建模型并研究MFI指数和不同指标以及生存预后之间的关系。本文的亮点在于作者开发了预测患者生存的MFI评分指数模型,并通过数据证明了MFI与生存指数相关。接下来作者通过MFI将患者分成了高低两组,比较两组之间功能差异和细胞浸润比例差异并发现低MFI组对免疫治疗更为敏感,这对LUAD精准个性化治疗提供了新的思路。最后通过对单细胞数据对结果进行补充,发现了MFI模型相关基因广泛分布于免疫相关细胞群中,而在恶性细胞中表达较少。
参考文献:Gu X, Cai L, Luo Z, Shi L, Peng Z, Sun Y, Chen J. Identification and validation of a muscle failure index to predict prognosis and immunotherapy in lung adenocarcinoma through integrated analysis of bulk and single-cell RNA sequencing data. Front Immunol. 2023 Jan 17;13:1057088. doi: 10.3389/fimmu.2022.1057088 . PMID: 36733390 ; PMCID: PMC9888242 .