大家好呀,今天分享的文章题为腹水液的单细胞测序显示了胃癌腹膜转移期间的异质性和治疗诱导的进化,于今年二月发表在Nature communication(IF: 17.694),本文通过在单细胞水平上分析不同组别的胃癌患者腹水液探索胃癌腹膜转移的发病机制,让我们一起学习一下吧!
Single-cell sequencing of ascites fluid illustrates heterogeneity and therapy-induced evolution during gastric cancer peritoneal metastasis
一、背景
胃癌(Gastric cancer , GC)是全球第五大诊断癌症和第四大癌症的死亡原因。胃癌腹膜转移(gastric cancer peritoneal metastasis , GCPM)是治疗性手术切除后常见的疾病,总生存期小于6个月。在手术期诊断为GCPM的胃癌患者从抗肿瘤治疗策略中获得的益处有限且GCPM发生发展的分子机制尚不清晰。因此,深入、动态地探索GCPM的发生和发展,有助于阐明GCPM的发病机制。本文通过分析不同GC单细胞数据探索GCPM的发病机制。
二、结果
1、胃癌患者的腹水或腹膜灌洗液中细胞生态系统的动态变化
本文对35例患者进行单细胞测序,包括4例良性子宫肌瘤患者(正常阴性对照,G0组)正常腹腔灌洗液,4例早期胃癌患者(G1组)腹腔灌洗液;10例晚期胃癌患者(G2组)腹腔灌洗液;12例未治疗诊断GCPM的晚期胃癌患者(G3组)腹水;5例全身治疗后确诊GCPM的晚期胃癌患者腹水(G4组)腹水(图1a)。另外收集了4例未确诊为GCPM的晚期胃癌患者的腹水样本,培养腹水PDOs进行基于抑制剂药物干预实验和免疫荧光分析进行实验验证(图1b)。对来自五组单细胞数据进行严格的质量控制、细胞过滤和去批次得到191987个细胞,鉴定出12个细胞簇(图1c)。基于单细胞数据进行拷贝数变异的分析,结果显示所有被鉴定出的上皮细胞均被证实为恶性肿瘤细胞。在GCPM进展过程中, 12个细胞簇表现出不同的分布,巨噬细胞/单核细胞和T细胞是腹腔内的主要细胞组成,分别呈减少和增加的趋势(图1d-e)。
2、单核细胞样树突状细胞在GCPM期间表现出较高的多样性和促血管生成表型
作者首先分析了G0-G3组,以探索GCPM过程中免疫细胞景观和免疫细胞的动态变化。髓系细胞主导着免疫细胞群,cDC2亚群在不同组间存在明显差异,随着胃癌的进展,这些细胞浸润到腹腔内的数量减少,特别是GCPM患者。为了探索细胞簇潜在独特功能作用,作者又将髓系重新划分为4个DC簇,3个巨噬细胞簇,2个单核细胞簇,1个中性粒细胞簇和1个肥大细胞簇(图1f)。C3-DC是一个cDC2簇,具有较低的抗原-呈递能力和较高的促血管生成能力,它似乎在很大程度上代表增殖的DC (图1f-g)。
采用功能评分来探讨GCPM过程中每种DC类型的功能变化,C1-DC和C4-DC簇在树突状细胞中抗原提呈能力最高,G3组抗原提呈能力无明显变化,而C2-DC和C3-DC-簇(单核样树突状细胞)在G3组抗原提呈功能评分和功能分子表达明显降低。在G3组GCPM过程中,C2-DC和C3-DC簇显示促血管生成功能评分和功能分子表达增加(图2a-b)。对四个DC簇进行拟时序分析,C1-DC和C4-DC簇位于起源,C2-DC簇位于中间,C3-DC簇抗原呈递能力较低,在拟时序的末端,促血管生成能力较高(图2c)。因此作者检测了树突状细胞的代谢重编程,观察到糖酵解和脂肪酸代谢沿单核细胞样表型逐渐增加,而氧化磷酸化在早期和中期增加,在分化后期略有下降(图2d)。拟时序热图发现C3-DC上调mTORC1激活和E2F信号通路相关基因,同时增强糖酵解、脂肪酸代谢、氧化磷酸化和胆固醇代谢;一些免疫检查点基因沿DC分化轨迹逐渐上调,特别是在晚期,表明C3-CDC可能抑制肿瘤免疫(图2e-f)。并验证了C3-DC簇基因特征与预后显著相关,使其成为GCPM不良临床结果的潜在指标。
3、T细胞抑制状态在GCPM进展中有不同的重构
T细胞在肿瘤免疫中起关键作用,本文又将T和NK细胞重新划分(图3a-b)。在腹膜生态系统中观察到一个以MKI67、MCM2和PCNA高表达为特征的增殖循环T细胞簇(图3a-c)。这些细胞表现出细胞毒性和幼稚细胞基因的低表达,以及抑制标志物的高表达(图3d)。与G0-G2组相比,G3组的细胞毒性功能评分及相应的标记基因GZMA和GZMH均降低。因此,增殖循环T细胞簇可能表现出一种功能失调的状态,并类似于一种幼稚的表型,GSEA分析表明,循环T细胞簇在参与细胞周期、糖酵解和DNA复制的基因中富集,可能准备增殖所需的材料和能量,并在细胞毒性基因中负富集。
作者研究了增殖周期T细胞簇的组成,发现它由两个CD8细胞簇(C1、C2循环T)和一个NKT细胞簇(C3循环T)的异质细胞簇组成(图3e)。与G1组和G2组相比,G3组的C2循环T细胞簇比例增加(图3f)。通过分化循环T细胞轨迹,发现轨迹始于C6-CD8幼稚簇,通过C4-CD8和C1循环T细胞簇,最终形成C2循环T细胞簇(图3g-h)。代谢转变对于CD8 T细胞的存活、增殖、分化和抗肿瘤免疫中的激活至关重要。观察到糖酵解、脂肪酸代谢和NAD代谢随着发育轨迹的变化而明显上调(图3g,i),增殖型C2循环T细胞高表达增殖基因,获得部分幼稚功能,导致细胞毒性功能降低,抑制功能增强(图3h,j)。因此C2循环T细胞簇可能代表了一个耗尽和功能失调的阶段。
4、治疗诱导的单核细胞样DC和循环T细胞免疫表型的进化
肿瘤生态系统中的细胞在治疗前后表现出很强的异质性,观察到治疗后C2-DC簇减少(图4a),治疗导致C3-DC细胞(早期显示为GC的晚期群体)获得增殖和促血管生成能力,其抗原的呈递能力显著降低(图4b)。C3-DC细胞显著上调炎症因子CCL2、CCL3和CCL4,可能招募炎症单核细胞、单核细胞样、中性粒细胞和巨噬细胞进入腹膜,导致促血管生成和免疫抑制生态系统。GSEA分析发现,G4组中的C3- DC细胞高表达了参与炎症反应、NF-kappa B信号通路、趋化因子信号通路、上皮-间充质转化和Notch信号通路的基因。相反,G3组中的C3-DC细胞高表达了参与抗原加工和呈递、MHC-II受体活性和T辅助细胞分化的基因(图4c)。
作者通过GSVA来评估G3组和G4组之间的单核细胞样DC簇的代谢活性;G4组中C3-DC簇上调氧化磷酸化和糖酵解,并伴有透明质酸代谢和嘌呤代谢;C2-DC簇显示线粒体功能下降,其特征是氧化磷酸化和脂肪酸线粒体氧化下调,糖酵解和丙酮酸代谢增加(图4d)。全身治疗显著降低了C3-CD4 Treg细胞的比例,在GCPM期间增加,抑制和幼稚功能降低,提示免疫抑制状态改善(图4e-f)。此外,功能评分分析显示,循环T细胞在抗肿瘤治疗下(G4组)表现出细胞毒性/增殖功能降低,而幼稚功能增加,提示循环T细胞功能可能会因治疗压力而沉默,这种转变可能是对抗肿瘤药物的自我保护机制。代谢分析表明,循环T细胞在治疗过程中经历了明显的代谢重编程,通过上调氧化磷酸化、柠檬酸循环和谷胱甘肽代谢,这可能与药物代谢有关(图4g)。
5、单核细胞样DC和循环T细胞免疫检查点的进化
癌症免疫治疗可以浸润到实体肿瘤中来重塑免疫细胞的表型,但其对腹膜的影响尚不清楚。作者通过比较免疫治疗(2例患者)和化疗(3例患者)的腹水样本,探索免疫检查点变化。与化疗相比,免疫治疗中C2-DC和C3-DC的比例降低(图5a),在功能上,C2-DC簇下调了抗原呈递能力,而促血管生成能力没有显著变化,C3-DC簇在免疫治疗中同时下调了抗原呈递能力和促血管生成能力(图5b)。通过比较两组之间的C2-DC DEGs,发现免疫治疗组的C2-DC细胞低表达MHC分子相关的基因。值得注意的是,免疫治疗后的C2-DC细胞对促炎表型呈负向富集,且抗炎相关基因高表达(图5c)。同样,C3-DC和C3-Macro簇在免疫治疗下表现出抗炎表型,NF-kappa B通路和促炎表型的负向富集,表明单核细胞样树突状细胞和TAM样巨噬细胞广泛向抗炎表型转移(图5d)。为了研究免疫检查点的表达模式,CD274(PD-L1)和PDCD1LG2(PD-L2)是PD-1相关免疫检查点的两种配体,在单核细胞样树突状细胞和TAM样巨噬细胞中很少表达。其他可以诱导T/NK细胞并随后抑制其细胞毒性免疫检查点如VSIR、MIF、LGALS9和SIGLEC10在C2-DC和C3-DC簇中表达,并且其在免疫治疗(与化疗相比)中增加(图5e)。接下来,作者探讨了在免疫治疗过程中腹膜浸润性T细胞的免疫表型变化,与化疗相比,免疫治疗中C2-CD4 naive和C3-CD4 Treg簇比例降低,表明免疫治疗可能减少免疫抑制T细胞簇(图5f)。此外,免疫治疗导致共刺激标记基因CD27、CD69和TNFRSF14的表达增加。细胞功能分析表明,CD8 T细胞的百分比高细胞毒性功能略有增加,进一步的功能评分分析显示,免疫治疗并没有明显增强T细胞的细胞毒性,但可以增加具有高细胞毒性功能的CD8 T细胞的百分比(图5g)。然而,免疫治疗显著诱导了几个免疫检查点的上调。免疫治疗组C3-CD4 Treg簇在免疫治疗后优先表达免疫检查点基因CTLA4、TIGIT、CD47、CD96和TNFRSF1B,免疫治疗后循环T细胞簇中VSIR、CD47、CD96和TNFRSF1B表达上调(图5h)。
6、高可塑性GC通过一个保守的细胞程序演变为高增殖性GC
作者将所有上皮细胞分为7个簇,C1-3肿瘤簇几乎被所有的GC病例所共享,而C4-7肿瘤簇仅在单个病例中存在(图6a)。比较了C1-3簇的增殖、分化和可塑性等肿瘤特征,发现C1-肿瘤簇具有高度分化能力,C2-肿瘤簇具有高度可塑性,C3-肿瘤簇具有高度增殖能力(图6b)。研究定义了一个上皮细胞可塑性程序,称为paligenosis,分为特征不同的三个阶段。paligenosis已被证明是分化细胞在癌前状态如胃化生等状态下回到祖细胞状态的过程,本文推断,GC主要源于化生病变,可能通过继续使用paligenosis来维持治疗的可塑性。c2-肿瘤簇具有高的自噬、高的可塑性和低的mTORC1活性,这是早期麻痹(1-2期)的特征。c3-肿瘤簇具有高的mTORC1活性和高增殖,是晚期paligenosis的特征。对C1-3肿瘤集群拟时序发现c1-肿瘤细胞增加了“分化”,减少“增殖”和“可塑性”表型。
GSEA分析发现治疗后C2-肿瘤簇可塑性增强(G4组),表现为Hedgehog、ERBB通路激活和细胞极化重构(图6c)。轨迹分析发现发现G3组的部分C2-肿瘤簇发展为G3组的C3-肿瘤簇,另一部分发展为G4组的高度可塑性的C2-肿瘤簇。在细胞轨迹的末端,G4组的C2-肿瘤细胞失去了一定的可塑性,获得了增殖能力,发展为G4组的C3-肿瘤簇。整个发育轨迹是细胞可塑性的持续进化,导致细胞增殖(图6d-f)。在C2-肿瘤-G4-Group簇富集的轨迹的中间,细胞具有上皮细胞的特征间充质转化。在细胞轨迹的末端,C3-肿瘤-G4-Group簇富集,细胞以细胞周期进入和Wnt通路激活为特征,表明G4组的C3-肿瘤细胞在获得增殖能力的同时保持了相当大的多能性(图6f)。G4组的C2-肿瘤簇和C3-肿瘤簇均表现出代谢重编程和多药耐药性增加。G4组的C2-肿瘤细胞进一步表现为线粒体功能下降,糖酵解和糖原代谢增加(图6g)。
7、自噬抑制阻断胃癌PDOs的凋亡并诱导凋亡
为了研究GCPM过程中的细胞调控,对所有细胞簇进行了细胞通讯的分析,令人惊讶的是,最强的细胞通讯是在C2和C3肿瘤细胞之间(图7a)。为了解码调控C2和C3肿瘤细胞的分子网络,在TCGA STAD数据库中寻找C2肿瘤细胞的DEGs、自噬相关基因和GC患者预后相关基因之间的交叉点,只有MARCKS和TXNIP存在于C2肿瘤细胞簇的所有三个基因集中(图7b);C3肿瘤细胞未发现交叉基因(图7c)。PDOs是针对癌症患者的基因进化研究、生物标志物鉴定和药物筛选的有效工具。对4例GCPM晚期胃癌患者的腹水样本进行PDOs分析,MARCKS和TXNIP蛋白的表达与晚期(3期)麻痹症标志物pS6和KI67的表达不相关,但它们与早期麻痹症标志物DDIT4、ATF3以及SOX9(由2期诱导)共表达(图7d),作者用自噬或mTORC1抑制剂治疗腹水,因为自噬诱导和mTORC1激活分别是早期和晚期麻痹的标志。自噬和mTORC1抑制剂均能显著降低了腹水的生长。与mTORC1抑制剂TORIN1和雷帕霉素相比,自噬抑制剂DC661和羟基氯喹对腹水生长的抑制作用更有效(图7e,f)。发现只有DC661或羟基氯喹诱导了类器官死亡,这表明自噬和mTORC1抑制剂通过不同的机制阻碍生长(图7e中红色箭头)。为了进一步分析自噬和mTORC1抑制剂治疗后的类器官死亡特征,用自噬或mTORC1抑制剂处理的PDOs对CC3((cleaved caspase3)和KI67进行染色。DC661和羟基氯喹显著诱导腹水PDOs细胞凋亡,与未处理的对照组和mTORC1抑制剂处理的PDOs相比,CC3/KI67阳性细胞的比例增加,证实自噬抑制导致麻痹失败,进而诱导细胞凋亡(图7g,h)。
三、小结
本文描述了35例胃癌腹膜转移(GCPM)患者的腹水癌/免疫细胞的单细胞转录组。在GCPM进展过程中,可见单核细胞样树突状细胞(DCs)的增加,这些细胞具有促血管生成作用,抗原呈递能力降低,并与胃癌(GC)预后不良相关。作者还探究了治疗后单核细胞样树突状细胞和调节性和增殖性T细胞的进化,比较了免疫治疗和化疗前后细胞变化和功能改变,最后使用细胞通讯和PDOs进行验证。本文通过对不同时期的GC样本进行单细胞测序,从而更加精准的划分细胞亚型,进行不同细胞簇的差异对比,更加细致的刻画了GCPM单细胞转录组景观。
参考文献:Huang XZ, Pang MJ, Li JY, Chen HY, Sun JX, Song YX, Ni HJ, Ye SY, Bai S, Li TH, Wang XY, Lu JY, Yang JJ, Sun X, Mills JC, Miao ZF, Wang ZN. Single-cell sequencing of ascites fluid illustrates heterogeneity and therapy-induced evolution during gastric cancer peritoneal metastasis. Nat Commun. 2023 Feb 14;14(1):822. doi: 10.1038/s41467-023-36310-9 . PMID: 36788228; PMCID: PMC9929081.