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肿瘤杀伤作用机制主要通过被抗原激活后的T细胞释放颗粒酶和穿孔素，对T细胞的多项研究发现存在很多不同功能状态的T细胞，其对免疫反应可能起到促进或抑制作用。今天给大家分享一篇发表在Nature Reviews Cancer（IF：69.8）杂志上的综述性文章，这篇文章详细描述了肿瘤反应性T细胞中不同类别细胞在分化、毒性、自我更新能力、增值能力等方面的特性，免疫组化、流式、质谱、单细胞等多项技术都可用于T细胞功能研究，而当下流行的scTCRseq技术，使得可以追踪不同T细胞在肿瘤进化过程中的动态变化。本文全面揭示了抗肿瘤T细胞免疫相关因素，可用于指导基于T细胞的各种免疫疗法的临床治疗。下面让我们正式开始吧~
研究背景
T细胞是免疫系统杀伤肿瘤细胞的主力军，是免疫治疗异质性研究关键点之一。随着单细胞技术的发展，当患者进行如免疫检查点抑制剂、过继性细胞疗法、癌症疫苗等免疫治疗方案时，研究肿瘤免疫微环境中T细胞的细胞状态的动态变化，特别是肿瘤特异性反应T细胞亚群特征成为可能。
T细胞免疫反应是通过TCR来完成，当机体受到抗原刺激时，通过TCR与MHC呈递抗原复合物相互作用，产生效应淋巴细胞，能够穿越组织并消除目标抗原，以及产生记忆细胞，它们可以在抗原再次攻击的情况下持续存在并提供长期保护。每个T细胞表面具有独一无二的TCR分子，对TCR的克隆性研究可以跟踪在癌症免疫治疗干预过程中抗肿瘤性T细胞分化轨迹、克隆进化以及表型变化。
研究结论
本综述详细阐述肿瘤特异性反应T细胞中不同类别在分化程度、细胞毒性、自我更新能力、抗原负荷、增殖能力、人体分布位置等方面的差异，TCR序列分析进一步揭示TME中不同T细胞状态与T细胞克隆性增殖相关性，追踪T细胞克隆动态和肿瘤进化过程。结合单细胞技术研究进展揭示癌症免疫治疗反应性T细胞特征，阐明与产生抗肿瘤T细胞免疫相关的因素，未来可用于指导设计更有效的治疗策略。
研究成果
TIL
在原生态的肿瘤微环境中，免疫T细胞可以浸润到肿瘤组织内部，也可以识别部分抗原表位，但无法完全消除肿瘤细胞。一方面可能是因为肿瘤细胞有限的免疫原性，而小鼠慢性抗原刺激模型和热肿瘤中TIL特征研究结果显示，抗肿瘤T细胞在癌症进展过程中逐渐出现功能障碍，从而引发免疫逃逸，恢复肿瘤免疫微环境中TILs的功能成为现在免疫治疗的重点。
目前scRNA数据主要通过去卷积方法从混合转录本数据中对T细胞进行亚群分类，由于T细胞广泛的功能状态、特异性TCR的数量庞大、T细胞反应在时间和组织间隔上是动态的，需要进行纵向样本收集，增大了分析难度。而把scRNA、scTCR-seq等单细胞技术和下面列举的多种其它免疫研究方法结合，可以提高T细胞亚群分析能力和准确性。
1）免疫组化技术直接对CD8+T细胞和CD4+T细胞计数，从而将肿瘤分为免疫学上的热肿瘤或冷肿瘤；通过有限的细胞标志物，多重免疫组化和免疫荧光可以获得特性细胞群体的细胞状态信息，同时保留定量和位置信息。
2）多参数流式细胞术可以对肿瘤组织解离后的单细胞悬浮液，利用有限细胞标志物，体外分离成不同T细胞亚群（<30），使得体外研究T细胞免疫反应性增殖和细胞因子产生成为可能。
3）金属同位素（>40）标记抗体对单细胞染色，结合飞行时间质谱技术，对特定单细胞表面蛋白进行检测。
4）scRNAseq对不同T细胞亚群表型特征进行研究，推测分化轨迹，scTCR-seq分析TCR克隆性，进一步确定T细胞的杀伤能力。随着抗原特异性筛选工具的出现，提供了关于可以结合TCR的表位的信息，从而刺激T细胞的细胞毒性活性。
图1. CD8+T细胞不同分化亚群
肿瘤免疫浸润T细胞（TIL）是影响癌症患者预后的重要因素，包括肿瘤内、肿瘤边缘T细胞检测以及肿瘤内T细胞毒性检测。不同癌症类型微环境中存在不同细胞状态的T细胞，这里的不同指的是细胞分化程度、细胞毒性、增殖能力和干细胞潜能的不同。“热”肿瘤通常富集CD4+T和CD8+T细胞，这类T细胞来源于前体T细胞被抗原刺激后激活和分化产生。
TCR克隆性
肿瘤免疫微环境中CD4+和CD8+ T细胞具有不同的表型，而肿瘤免疫作用取决于它们通过TCR参与接收的主要信号，在胸腺发育过程中V（D）J重组形成的TCR独特的分子条形码，可以用来检测和跟踪T细胞在不同时间段和身体部位的克隆动态。TME中的主要克隆通常被用作肿瘤抗原局部识别的间接证据，当对基于离散免疫标记分离的TILs细胞亚群进行TCR测序，可以更详细地了解特定T细胞状态与TME内克隆扩增相关性以及推断TME内T细胞克隆进化情况。有研究发现，大部分TILs克隆具有非重叠的PD1+或PD1-分布，这表明单个T细胞克隆倾向于优先获得耗竭或非耗竭表型，克隆扩增CD8+TIL优先显示耗竭表型。单细胞转录组分析加上 scTCR-seq（检测到配对的TCRα链和β链信息），为TME内克隆型动力学的表征提供了前所未有的分辨率。最近对黑色素瘤的TILs进行TCR测序分析发现，Tex具有较低的TCR多样性，与高肿瘤内克隆扩张一致，而Tex细胞的TCR克隆可以在Tpe和Tte中追踪到，提示这些不同细胞状态存在一个连续体。克隆扩增的TCR也可以在Tmem细胞内观察到，但它们与Tex细胞的TCR是不同的且不重叠，表明抗原特异性在塑造T细胞表型属性中起着关键作用。
除了TME中T细胞克隆性的测量外，其他研究还试图基于不同解剖位置的对比分析来推断抗肿瘤特异性T细胞克隆分布模式。一项对RCC TME的研究报告称，肿瘤组织TCR多样性比正常组织低（即克隆扩展的TIL更多），与肿瘤抗原识别驱动的细胞扩张的概念一致，寡克隆与获得耗竭的表型有关，并随着疾病分期的加深而逐渐增加。多项实体瘤研究发现，TME中Tex细胞中扩增的CD8+TCR克隆型在外周血中很少检测到，平均占循环T细胞库的0.1%，而在肿瘤内Tmem细胞中发现的克隆型很容易在外周检测到，占循环T细胞的10%-15%。
定义肿瘤特异性反应T细胞
肿瘤特异性反应T细胞即T细胞对肿瘤细胞或肿瘤抗原具有反应性，TCR主克隆对应细胞群通常代表具有局部抗原反应的T细胞亚群，但有研究表明大部分克隆扩增TILs并不具备抗肿瘤活性。一项大型肺癌和结直肠癌研究发现，具有非耗竭表型的CD8+ TILs能够识别广泛的病毒表位（EBV、CMV和流感等），但由于缺乏激活或衰竭标记以及无法识别肿瘤抗原，这种存在于TME中的Tmem细胞被归类为“旁观者”。病毒特异性淋巴细胞表现出优先记忆表型这一事实并不令人惊讶，因为记忆细胞通常是在抗原负荷被清除后急性感染后产生的。“真正的”抗肿瘤TIL的特征需要区别于旁观者，即证明T细胞对肿瘤细胞或肿瘤抗原的反应性。
肿瘤抗原包括两大类，肿瘤相关抗原（TAAs）和肿瘤特异性抗原（TSAs），前者在肿瘤细胞和正常细胞都有表达，但在肿瘤细胞中表达模式是异常的，后者只在肿瘤细胞中有表达。
TILs去卷积还有一大难点是无法确定对自体肿瘤细胞具有抗肿瘤活性的TCR，而通过在体外将表达TCR序列细胞和肿瘤细胞进行反应测定具有挑战性，因为大多数肿瘤细胞在体外繁殖能力差。对于黑色素瘤患者来说，建立自体来源的细胞系是最可行的。有研究证明，在黑色素瘤中表达抑制性受体的CD8+TIL，如PD1、LAG3和TIM3（即Tex细胞），在体外纯化和攻击自体肿瘤细胞时，显示出最高水平的激活（即CD137表面上调）、效应细胞因子（如干扰素γ）的分泌和靶向溶解。其他一些研究虽然没有直接评估肿瘤反应性，但通过多肽-主要组织相容性复合体（MHC）多次染色证实了肿瘤抗原特异性T细胞的耗竭表型。
病毒特异性旁观者T细胞是如何被招募到肿瘤免疫微环境中的，可能通过如下几种方式：
1）具有Tmem表型的细胞能够通过表达不同的归巢（CD62L和CCR7）和迁移受体（细胞间粘附分子1（ICAM1）和血管粘附分子1（VCAM1））在次级淋巴器官和外周组织之间循环；
2）大多数肿瘤同时表现为高血管化和炎症（尽管程度取决于不同的肿瘤类型），可能导致T细胞吸引和定植；
3）病毒特异性T细胞在循环中以高频率被检测到，这增加了它们在TME内再循环的可能性。
不管导致病毒特异性T细胞归巢进入TME的机制是什么，我们不能排除，一旦进入TME，它们可能潜在地参与抗肿瘤活性，这是最近提出的由炎症线索触发的间接和TCR独立激活。
抗肿瘤活性TILs
scTCR-seq可以得到T细胞配对的TCRα链和β链信息，通过体外合成瘤内TCR导入报告细胞，和自体肿瘤细胞共培养，通过测定抗原特异性激活来筛选治疗性T细胞。TILs的扩增数量并不等同于抗肿瘤反应性，这很大程度上取决于肿瘤类型。一项黑色素瘤研究发现，TME内的抗肿瘤T细胞存在于从Tpe、Tte和Trm-like Tex表达状态分化的连续体中。与之形成鲜明对比的是，Tmem TILs占肿瘤特异性区室的比例不到2%。进一步的研究将scTCR-seq和全转录组分析与体外筛选TCR对有限肿瘤抗原的特异性结合起来（图2），以评估TME内抗肿瘤特异性的广度。这一系列深入的研究一致表明，实体肿瘤中的肿瘤特异性T细胞几乎完全存在于Tex细胞中，肿瘤表达抗原的特异性，而不是抗原类别本身（TAA or TSA），驱动TME内的T细胞耗竭。肿瘤反应性TILs的特征现在越来越多地用于肿瘤活检中推测的肿瘤反应性TILs的预测，如检测TILs中PD1和CD39的表达以量化可能对肿瘤抗原特异性的T细胞；评估肿瘤反应性CXCL13+ Tex TILs水平已越来越多地被用作许多具有高肿瘤突变负担的实体肿瘤的预测指标，因为它与免疫治疗后预后的改善有关。
图2. 具有抗肿瘤活性TCR配体鉴定方法列表
相对较少的研究关注在CD4+T细胞上，但图2中单细胞测序和TIL反应性筛选的广泛研究表明它们对TIL中的私有新抗原和TAA具有特异性。有个疑问是，CD4+T细胞是否能识别肿瘤细胞，因为肿瘤细胞表面缺乏HLA II类表达。黑色素瘤体外测量TCR对自体肿瘤的反应性揭示了CD4+ TILs与癌细胞之间不同的相互作用模式，CD4+ T细胞可以通过APC激活，也可以直接识别肿瘤细胞杀伤，映射为TME中的PD1+ CXCL13+ Tex细胞簇，并显示细胞毒性（表达IFNγ和颗粒酶A）。在同时具备TME炎症的情况下比较明显的，CD4+ T细胞在HLA II类表达异常的黑色素瘤亚群中的直接激活。虽然肿瘤特异性Treg细胞TCRs可以被癌细胞刺激，目前尚不清楚肿瘤细胞是否可以诱导具有免疫抑制功能的CD4+ TILs，或者更有可能是通过抗原模仿作用于已有的Treg细胞。未来的研究将需要评估肿瘤特异性Treg细胞如何在TME内外分化。
基于T细胞的免疫疗法
T细胞免疫疗法主要是利用抗肿瘤T细胞的不同特性来增强T细胞功能以达到杀死肿瘤细胞的目的，包括TIL疗法、免疫检查点抑制剂（ICB）、癌症疫苗和过继性细胞疗法等。其中TIL疗法是靶向TME中已存在的抗肿瘤T细胞，在体外对其扩增后再重新高剂量输回体内，使得抗肿瘤反应在肿瘤外部位（淋巴结、外周血、正常组织）得以扩大。ICB主要是重新激活TME中的抗肿瘤T细胞，释放更多的趋化因子和细胞因子，而细胞因子的释放有利于T细胞从肿瘤外的部位募集，增强抗肿瘤反应。TIL和ICB都是靶向已存在的抗肿瘤T细胞，而癌症疫苗和过继性细胞疗法有所不同，它们是产生新的抗肿瘤特异性T细胞。癌症疫苗可以诱导抗原提呈细胞介导的抗原未经历T细胞的启动，过继细胞疗法是直接在体外对T细胞进行改造，在细胞表面插入天然T细胞受体（TCR）或嵌合抗原受体（CARs）直接对肿瘤细胞进行杀伤。免疫疗法诱导的有效抗肿瘤T细胞可以溶解肿瘤细胞，从而促进释放额外的肿瘤抗原（epitope spreading），这些抗原可以由抗原呈递细胞呈递。epitope spreading可以进一步促进先前存在的反应的扩增和重新激活，以及诱导新的T细胞特异性。
图3.不同T细胞免疫疗法作用方式对比
免疫检查点抑制剂（ICB）
ICB是实体瘤中最被广泛应用的免疫疗法，其中基于靶点PD1、CTLA4、LAG3已被FDA批准用于各类实体瘤的治疗，虽然已证明其有效性，但只在少部分患者中达到持续或完全缓解。因此有必要在治疗前、治疗期间或治疗后对活检组织或外周血中T细胞进行克隆跟踪，以了解ICB对T细胞组成和功能的影响。
ICB治疗的完全或部分应答与原生肿瘤微环境（TME）内不同的T细胞组成以及瘤外部位（外周血、正常组织和引流淋巴结）更广泛的T细胞库有关。根据肿瘤类型、分析时间和临床环境，应答者可以表现为肿瘤内组织驻留记忆T细胞样耗竭T细胞（Trm-like Tex）的高频率，具有高细胞毒性，原始耗竭T （Tpe）细胞的增加，具有高再生能力，或肿瘤外部位假定的肿瘤反应性T细胞的扩张和浸润增加，这些特征被认为是对ICB反应的机制基础。相反缺乏这样的T细胞群，因此，末端耗竭T （Tte）细胞的频率很高，不能实质性地重新激活，使患者容易产生无效的免疫治疗反应。
患者经过ICB治疗后，首先通过破坏免疫抑制作用，ICB抗体可以释放抗肿瘤Trm-like Tex细胞的细胞毒活性，这些细胞可以在TME内进一步扩大。这种机制，即所谓的“细胞毒性恢复”，在头颈部鳞状细胞癌和乳腺癌的新辅助ICB治疗（2-4周）后早期观察到。其次，ICB具有全身性作用，有利于肿瘤外部位的新（或以前未检测到的）T细胞特异性的肿瘤内浸润。新招募的T细胞克隆可能在ICB抗体存在的情况下产生抗肿瘤反应，这可能会阻止细胞毒性的抑制。这种“克隆替代”最初是在基底细胞癌和鳞状细胞癌患者治疗后9周的中位时间出现的。在一些临床环境和癌症类型中，这些T细胞库的系统动力学已被观察到作为治疗后早期（2-4周）反应的预测。最后，应答可以通过祖细胞或早期功能失调的肿瘤特异性T细胞（Tpe细胞）在TME内扩增和分化或从淋巴结和外周组织募集来维持。这已经在肺癌和黑色素瘤病变中观察到，其特征是治疗后晚期（1 ~ 2个月）Tpe细胞的积累。这种现象被称为“克隆恢复”，因为它的特点是功能失调程度较低的细胞的积累，在ICB介导的抑制信号破坏存在的情况下，这些细胞有可能再生出具有肿瘤细胞毒性的效应细胞的后代。应该强调的是，上述对ICB的反应机制不是相互排斥的，而是可以代表在治疗后不同时间阶段发生的互补甚至协同的事件。
图4.ICB治疗前后T细胞组成和功能分析
癌症疫苗
癌症疫苗通过选择性地富集T细胞对预先定义的肿瘤抗原的反应性来促进抗肿瘤反应的重新激活和激发，通过增加APC介导的癌症抗原的呈递，疫苗接种既可以增强预先存在的肿瘤反应，也可以启动T细胞前体的新生分化，“引导”抗肿瘤免疫反应的特异性，使其针对特定的免疫原性抗原。不同的癌症疫苗，其活性成分不同，包括靶向肿瘤抗原的类型、配方、免疫佐剂和递送载体等。一些研究通过追踪循环T细胞对目标抗原的反应性，调查了癌症疫苗如何影响T细胞库。从这些研究中发现，高达60-70%的预测新抗原能够诱导反应性T细胞。有趣的是，虽然疫苗接种方案旨在诱导CD8+ T细胞，但应答主要由多克隆CD4+ T细胞组成，这可能是APCs HLA II类分子上长免疫抗原的加工和呈递所支持的。
通过单细胞测序和多参数流式细胞术分析，最近在8例黑色素瘤患者中完成了一种癌症疫苗诱导的新抗原特异性CD4+ T细胞的详细表征。疫苗反应性T细胞在接种疫苗后的头几个月扩大，并在接受治疗的患者中持续4年。在接种疫苗后的早期阶段，针对新抗原的CD4+ T细胞表现出具有激活和衰竭特征的细胞毒性谱；在治疗后收集的肿瘤病变中检测到它们的TCR，证明了这些细胞能够在TME内运输。在较晚的时间点（接种疫苗后5年），拥有相同克隆型的T细胞表现出记忆表型，至少在循环中是这样。
过继性细胞疗法
过继性T细胞疗法（ACT）旨在定量和定性地增强抗肿瘤免疫，这可以通过两种方式实现：1）扩大体内已有的抗肿瘤特异性T细胞（TIL治疗）；2）通过使用抗肿瘤TCR或嵌合抗原受体（CARs）进行基因操作来重定向体内T细胞的特异性，这可以刺激新生抗肿瘤反应。
Rosenberg小组的开创性研究首先证明了从手术切除的肿瘤碎片中分离的TIL如何在体外扩增，筛选对自体肿瘤细胞的识别，然后再输注到患者体内，这种过继性TIL治疗方法的研究最初达到了约20%的完全临床反应。TIL治疗的一个主要优势是其多克隆性：对输注TIL不同批次的分析一致表明，TIL产品含有广谱的T细胞特异性，包括TAA、新抗原和癌病毒蛋白。虽然TIL治疗是ACT发展的一个里程碑，但它受到肿瘤内预先存在的抗肿瘤T细胞数量要求的限制，其数量可能不足以满足所有患者，特别是在肿瘤突变负担较低的肿瘤类型的背景下，例如黑色素瘤。为了克服这一限制，许多研究小组已经将重点放在基因操作上，以工程TCR或CAR的形式重新定向T细胞对肿瘤抗原的特异性。
使用经过基因工程改造的T细胞来表达肿瘤特异性TCRs，需要对TCRs进行分离、测序和验证，这些TCRs能够在给定患者的HLA背景下识别肿瘤抗原。因此，这种方法受到了一定的限制，部分原因是由于HLA的高频率限制导致难以找到针对公共TAAs的高亲和力TCR。当ACT方法使用针对TAAs的特异性TCR时，由于其在健康组织上的表达可能较低，因此需要进行广泛的临床前测试。通过测序和分离新抗原特异性TCRs来鉴定肿瘤特异性突变，为克服这一障碍提供了一种潜在的解决方案。
CARs的出现彻底改变了ACT领域，因为这样的结构使得靶向表面肿瘤蛋白以一种不依赖于HLA的方式进行。CAR通常需要数千个靶表面分子来介导有效的反应，只有在确定肿瘤细胞上具有高、广泛和保守表达的表面蛋白时才可行。这对实体瘤来说是具有挑战性的，因为它们具有很高的瘤内克隆异质性和免疫抑制潜力；然而在神经母细胞瘤和肉瘤中使用CAR特异性的双神经节脂苷GD2和人表皮生长因子受体2 （HER2）获得了令人鼓舞的结果。相反地，CART细胞在治疗血液肿瘤方面表现出显著的成功，主要针对表达CD19、CD20、CD22的B细胞急性或慢性血液肿瘤。 CAR-重定向T细胞是一种合成分子，在提供抗原识别的同时，通过一个或多个共刺激内结构域（这可能取决于特定的CAR结构设计）进行非生理性的顺式共刺激;对于CD19 CAR，即使在清除肿瘤细胞后，正常B细胞上也有可能通过识别CD19而产生本构性强直CAR信号传导，临床表现为B细胞发育不全延长。
过继T细胞的表型组成影响治疗结果，具有抗肿瘤潜能的输注T细胞的质量是促进其体内持久性和转移到癌症患者后的功能的主要因素。抗肿瘤T细胞可以从肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）或外周血单核细胞（PBMCs）中扩增出来，并且可以通过引入天然T细胞受体（TCR）或嵌合抗原受体（CARs）来进一步操纵它们，使其特异性转向肿瘤抗原。这种T细胞的体外激活导致具有多种表型的T细胞扩增，一旦T细胞转移到癌症患者体内，就会影响其动力学和功能。输注产品富含再生潜力低的衰竭T （Tex）细胞表型（终末衰竭T （Tte）细胞和组织常驻记忆细胞样耗竭细胞（Trm-like Tex），只能提供短期的抗肿瘤功能，在体内迅速下降，因此对癌细胞的控制有限。事实上，在接受过继性T细胞疗法（ACT）治疗的患者中，输注的Tex细胞克隆在输注后（2-4周）早期收缩，由此产生的抗肿瘤T细胞的低持久性与疾病进展或复发有关。相反，富含记忆T （Tmem）细胞的T细胞产物与转移的抗肿瘤T细胞的高水平持久性有关，进而与对ACT的反应有关。输注T细胞更好的适应性来自于具有再生潜力的细胞（Tmem细胞）的存在，或者在有限程度上来自于原始耗竭祖细胞（Tpe）细胞的存在，这些细胞可以在体内扩增、长期存在并分化产生大量的效应物，从而成功地控制肿瘤。因此，ACT可以从有利于非耗尽抗肿瘤T细胞的体外生成和扩增的方法中受益。
图5. 过继T细胞表型影响治疗疗效
总之，体外构造T细胞疗法如果富集了具有Tmem细胞特征的抗肿瘤T细胞，与体内T细胞持久性和疾病控制有关，而那些富集了抗肿瘤Tex细胞的方案在注入患者体内后，T细胞适应性就很差。
总结
随着单细胞转录组、单细胞TCR-seq、空间转录组及空间蛋白组等技术的发展及其在从癌症生物标本中表征T细胞库特性方面的应用，使得对患者和临床前模型中抗肿瘤T细胞的细胞状态的解剖成为可能。通过纵向追踪患者的这种T细胞特异性，我们可以更好地了解与产生生产性抗肿瘤反应相关的动力学。在免疫热肿瘤中，癌症的生长伴随着具有多种抗肿瘤潜力的耗竭T细胞的诱导，成功的肿瘤控制需要这些功能的重新激活和/或重新布线。随着T细胞分析技术的不断进步及其在人类样本中的应用，我们可以更好地理解成功免疫疗法背后的生物学事件，并将这些发现转化为新的治疗选择，以促进所有癌症患者的抗肿瘤T细胞免疫。
