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本月中山大学陈明远教授在nature communications（IF：17.694）发表了研究论文，该研究探索了与鼻咽癌(NPC)转移相关的因素。对163个匹配的血液和原发性、区域淋巴结转移和远处转移肿瘤样本进行了整合基因组分析，并结合了来自两名患者的11个样本的单细胞RNA-seq。研究了转移性肿瘤与原发性和区域性淋巴结肿瘤异同。进而研究了转移的不同途径及其特点。
鼻咽癌(NPC)起源于鼻咽上皮，在东南亚最常见，中国广东广东人的发病率最高。临床试验表明，化疗加大剂量局部放疗可以提高新生转移性鼻咽癌患者的总生存率(OS)。此外，局部放疗还减少了远处转移性复发。然而，63例患者中有17例在局部放疗结束后未达到客观缓解(完全或部分缓解)。因此，揭示促进这种协同作用的机制，并筛选适合高强度局部放疗的患者是至关重要的。大规模的基因组和转录组测序研究揭示了鼻咽癌样本的突变格局和不同的亚型。但目前没有对转移鼻咽癌的基因组结构做出定义，进而识别转移的时间或空间模式。
首先，从44名鼻咽癌患者中获得了167个肿瘤样本(83个原发病灶、44个区域淋巴结病变和40个转移病灶)和35个匹配的血液样本(图1a)。并对这些样本进行全外显子组/全基因组测序(WES/WGS)、RNA-seq、scRNA-seq(图1b)。转移性肿瘤样本具有与原发性和区域性淋巴结肿瘤相似的非沉默突变负荷(图2a)。原发性、区域性淋巴结和转移性肿瘤的主要替代类型是C > T转移，这也是不同鼻咽癌病理亚型报告的主要特征(图2b)。使用非负矩阵分解，在所有样本中识别出5个稳健突变signature，并根据COSMIC数据库将5个突变标记被注释为2、4、5、6和13 signature(图2c-e)。总的来说，不同的样本有不同的显性突变特征，但AID/APOBEC相关的特征，包括Signature 13和Signature 2，是所有样本中贡献最大的两个特征，转移性肿瘤样本的突变谱的总体模式与原发性和区域性淋巴结肿瘤样本的突变谱相似(图2f)。Signature 6在转移性肿瘤中的主导地位进一步表明，缺陷DNA错配修复可能对NPC的进展产生广泛而重要的影响(图2d，e)。
为了评估鼻咽癌中的瘤内异质性（ITH），作者重建了系统发育树(图3a，b)。平均而言，在原发和区域淋巴结肿瘤中，分别只有20.79%和22.29%的突变表现为所有区域共有的主干突变。这说明原发性和区域性淋巴结肿瘤中存在大量高ITH。此外，通过根据癌细胞分数(CCF)将体细胞变异分为克隆和亚克隆突变，转移性肿瘤中亚克隆突变的比例与原发和区域淋巴结中的相当(图3c)。亚克隆突变在原发肿瘤中的比例与区域淋巴结/远处转移肿瘤中的比例呈正相关(图3d)。作者还采用MATH评分来评估肿瘤的ITH，结果显示，原发性、区域淋巴结和转移性肿瘤的ITH相似（图3e，f)。这些结果表明鼻咽癌具有较高的ITH，区域淋巴结和转移性肿瘤可能继承了这一特征。
然后，使用MutSigCV分别鉴定原发、区域淋巴结和远处转移肿瘤中的显著突变基因(SMGs)。除了在之前报道中提到的频繁突变的基因，还发现了其他SMGs，如SIX2和RPLP1(图1c)。生成了31个“driver genes”的组合列表(图1c)。虽然大多数驱动基因在三个位点的突变频率高度相似，但SIX2和NOTCH2在转移性肿瘤样本中的突变频率明显高于原发肿瘤样本(图1c)，提示SIX2和NOTCH2可能在鼻咽癌转移中发挥重要作用。（SIX2是一种发育转录因子，通过上皮-间充质转化(EMT)途径或诱导癌症干细胞程序促进乳腺癌转移。NOTCH2是一种新发现的癌基因，通常在一系列癌症中过度表达，可促进膀胱癌的肿瘤生长和转移。）
通过GISTIC算法使用WES数据获得体细胞拷贝数改变(SCNAs)。并根据GISTIC2获得了“扩增(AMP)”和“缺失(DEL)”改变(图1d)。与原发肿瘤相比，区域淋巴结或远处转移肿瘤中未检测到明显差异的SCNAs。先前报道的众所周知的9p21.3 (CDKN2A)、3p21.31 (RASSF1)等拷贝数缺失和11q13.3 (CCND1)、3q26.1 (PIK3CA)等扩增在所有三个位点均普遍存在。尽管在鼻咽癌中发现了高ITH，但原发性、区域性淋巴结和远处转移性肿瘤的基本基因组特征是相似的。
为了研究鼻咽癌转移过程中选择的驱动事件，作者系统地描述了每种变体的克隆性以及基于变体CCFs的转移性鼻咽癌的肿瘤亚克隆结构。在转移过程中，根据原发肿瘤和转移肿瘤之间的克隆性动态变化，11,148个变体被分为四组(图4a)：
NFKBIA、TET2、BAP1、TP53和FAT1等驱动基因存在体细胞突变的克隆在转移中明显“selected”(图4a)。此外，所选组的体细胞突变在EMT、有丝分裂纺锤体、根尖连接、炎症反应和E2F靶标等癌症转移相关通路中显著富集(图4b)。
据报道，大约20%-30%的鼻咽癌患者在标准放化疗后会发生远处转移。
在治疗后转移性肿瘤中持续存在的克隆变异可能不仅与治疗耐药性有关，还可能与肿瘤转移有关。首先，如KRAS扩增、JAK2扩增、CADM1缺失和NFKBIA缺失，在残余原发肿瘤中是克隆的，但在预处理原发肿瘤中是亚克隆的或无法检测到的，这表明这些事件可能与治疗耐药性和进一步的转移进展有关(图4d)。（KRAS已知在各种癌症类型中赋予化疗耐药；NFKBIA是NF-κB通路的知名负调控因子，据报道可增强鼻咽癌的化疗耐药性。）其次，TP53、ARID1A和TRAF3等基因中的SNVs和ATG13缺失、KMT2D扩增和ARID1A缺失等CNVs在治疗后进展性转移肿瘤中明显“selected”(图2e)。除EP300扩增、FBXW7缺失和PTEN缺失外，大多数在治疗后转移瘤中“selected”CNVs也被发现在预处理转移样本中“selected”(图4c，e)。（EP300是食管癌鳞状上皮癌中最重要的基因，通过下调FBXW749来改变肿瘤相关巨噬细胞的极化，从而促进弥漫性大b细胞淋巴瘤的肿瘤进展。FBXW749是一种关键的肿瘤抑制因子，在超过30%的人类癌症中被删除。）EP300扩增和FBXW7缺失可能对鼻咽癌转移的进展有协同作用。此外，在残留原发肿瘤中发现的所有“selected”变异在治疗前和治疗后的转移样本中也“selected”，这证明这些变异不是由治疗引起的，可能在引发远处转移中起着至关重要的作用。
作者进一步检查了治疗后主要残留样本患者(P27, P31和P32)的系统发育树拓扑结构。发现治疗前的进展性转移样本和原发样本聚类在同一分支中，表明治疗后的进展性转移病灶与治疗前的原发病灶相关，可能源于治疗前的原发病灶克隆。相比之下，进展性转移样本和治疗后原发性残留样本在P32中聚类为同一支，表明进展性转移可能源于治疗后原发性残留病灶的克隆(图4f)。根据P32的系统发育树，在进展性转移样本和治疗后残留的原发肿瘤样本中都存在克隆性NFKBIA缺失，但在预处理原发肿瘤中不存在；克隆性ARID1A缺失仅在进展性转移中被检测到(图4g)。这表明NKFBIA缺失和ARID1A缺失可能导致了P32的治疗耐药性，并进一步引发了远处转移。
根据系统发育树的拓扑结构，作者识别了两种转移的进化途径：
采用bootstrapping策略来评估每个转移的转移途径的概率。从两名患者(P05和P06)中筛选出了不符合概率临界值(0.75)的两个转移瘤，从8名患者中筛选出了11个经淋巴途径播撒的转移性瘤；5名患者中有8个通过血行途径传播的转移性瘤(图5b)。
基于突变CCF的亚克隆进化分析进一步证实了该发现。淋巴途径的转移性肿瘤与区域性淋巴结肿瘤共享至少一个私有亚克隆，而血液途径的转移性肿瘤与区域性淋巴结肿瘤不共享任何亚克隆(图5c)。相比之下，P04的转移瘤(甲状腺)血源性进化模型起源于原发肿瘤。P04的远处转移性和区域淋巴结肿瘤没有聚集到系统发育树的同一分支中，也没有共享任何私有亚克隆(图5d)。总体而言，除P14-Met3和P01-Met外，89.47%的远处转移病灶的进化路线通过亚克隆进化分析得到验证。
来自同一病人的不同转移性肿瘤倾向于遵循相同的进化路线。P07的肝和肺转移是从区域淋巴结演化而来的，P14的所有转移肿瘤(肝、骨和腹股沟淋巴结)也都是从区域淋巴结肿瘤演化而来的(图5e，f)。同样，P15的所有远处转移性肿瘤(多个腋窝淋巴结)都来自原发肿瘤(图5g)。
进一步对来自淋巴(P14)和血行(P15)转移患者的匹配的原发性、区域性淋巴结和远处转移性肿瘤进行了scRNA-seq，得到了53913个细胞(图6a-c)。绘制样本来源的细胞，通过Monocle2观察到连续的肿瘤进化轨迹(图6d-e)。有趣的是，原发肿瘤细胞首先迁移到区域淋巴结，然后按照不同的路线扩散到骨和腹股沟淋巴结或肝脏，这与利用基因组数据构建的系统发育树揭示的淋巴进化路线密切一致(图6d)。相比之下，来自原发和转移部位的恶性细胞混合，在P15中没有发现与样本来源相关的明确进化路线，这可能是由于肿瘤细胞从原发肿瘤直接扩散到区域淋巴结或由系统发育树揭示的远处转移(图6e)。
接下来，作者研究了这两种途径是否具有不同的基因组特征。突变signature 6(DNA错配修复相关)在血行途径中显著富集(图7a)。通过淋巴途径转移瘤比血行途径的转移瘤具有明显更多的“selected”突变(图7b)。
bulk RNA-seq和scRNA-seq数据显示，淋巴途径的原发肿瘤在EMT、UV反应和血管生成等途径中显著富集，而血行途径的原发肿瘤在IFN-α和IFN-γ反应途径中显著富集(图7c，d)。假设血行途径原发肿瘤的免疫微环境中应该存在更多的耗竭T细胞，这有利于肿瘤细胞的扩散。重新聚集P14和P15原发肿瘤的免疫细胞。发现P14(淋巴途径)和P15(血行途径)的肿瘤免疫微环境有显著差异。CD8+ T细胞在P14(淋巴途径)中显著升高。CD8+ T细胞进一步聚成8个亚簇，并提取每个亚簇的标记(图7e，f)。细胞毒性降低的C7_CXCL13高表达耗尽标记物在P15(血行途径)中显著丰富（图7g）。进一步通过标记物CXCL13、TIM3和CD8的多重免疫组化(IHC)染色验证了该结果(图7h)。由于免疫检查点抑制剂(ICIs)可以重新激活耗尽的T细胞，因此有理由假设C7_CXCL13的富集可能表明对免疫治疗有良好的反应。为了确定高表达CXCL13的耗竭CD8+ T细胞的富集是否与免疫检查点封锁(ICB)更好的疗效相关，作者收集了两个公开scRNA-seq数据集，发现在膀胱细胞癌(BCC)和透明细胞肾细胞癌(ccRCC)中，衰竭的CD8+ T细胞在对ICB敏感的患者中比在对ICB耐药的患者中更普遍。这些线索表明，通过血行途径转移的鼻咽癌患者可能对免疫治疗产生良好的反应。
经血行途径转移的患者原发病灶较大，但区域淋巴结较低区域受累较少，骨转移病灶较少(图8a-c)，如图P01淋巴途径(图8d)和P03血行途径(图8e)所示。作者提取原发肿瘤的图像特征，然后建立一个基于机器学习的预测模型，以13例具有基因组证据的患者的放射组学数据为训练数据集，从血行途径中识别淋巴路径;该模型获得了1.0的高准确率和1.0的AUC(图8f)。此外，将放射组学预测模型应用于治疗前没有完全配对的原发性、区域性淋巴结和转移性肿瘤样本的患者。对于P25和P27，放射组学预测模型的结果与基因组证据相一致(图8g)。此外，通过放射组学模型预测的血行途径的原发肿瘤比淋巴途径具有更高的IFN-α和IFN-γ反应途径活性(图8h)，这与先前基于具有基因组证据的样本的结果一致。
为了验证放射组学预测模型的准确性，作者收集了额外匹配的原发性、区域性淋巴结和转移性肿瘤(P49-P53)，然后利用放射组学预测模型构建基因组系统发育树并同步预测转移路径，结果表明基于基因组数据的系统发育树与放射组学预测结果一致(图8i)。然后，将放射组学预测模型应用于更大的临床队列，包括从头转移性鼻咽癌队列和免疫治疗队列。临床队列中淋巴和血行途径的影像学特征与训练数据集一致。由于临床诊断的患者大多处于M0期，最终可能发生转移，因此尽早预测转移路径并实施特定的治疗方式将会有很大帮助。因此，将预测模型应用于M0期鼻咽癌队列，发现血行组原发肿瘤的大小更大，下颈部淋巴结的数量比淋巴组更少。这些结果表明，放射组学预测模型可以对淋巴和血行途径进行分类。
在13例有基因组证据的鼻咽癌转移患者中，5例血行转移患者的无进展生存期(PFS)长于8例淋巴转移患者(图9a)。在招募的104例新生转移性鼻咽癌队列中，26例通过血行转移途径转移的患者的2年PFS时间明显长于78例通过淋巴途径转移的患者(图9b)。
在104例转移性鼻咽癌患者队列中，治疗结束评估转移病灶时，局部区域放疗与淋巴转移途径患者的客观缓解率(ORR)显著高于不进行局部区域放疗。相比之下，对于经血行途径转移的患者，局部区域治疗与不进行局部区域放射治疗相比，ORR没有显著提高(图9c)。此外，淋巴转移途径的患者治疗中加入局部区域放疗可改善疾病控制，而血行转移途径的患者没有明显受益于联合局部区域放疗(图9e，f)。
此外，在66例接受托利帕单抗、阿帕替尼和吉西他滨联合免疫治疗的免疫治疗队列中，14例血行组患者的ORR显著高于52例淋巴组患者(图9d)。这些发现表明，淋巴和血行转移途径可能有效地对疾病进展高风险的患者进行分层，并可能用于选择特定患者进行局部区域放疗或免疫治疗。
在这项工作中，作者收集了配对的鼻咽癌原发和转移性肿瘤样本，并进行了基因组和转录组测序，包括scRNA-seq，来追踪鼻咽癌远处转移的进化历史。通过对成对的原发和转移性鼻咽癌的大规模bulk和单细胞测序数据的综合分析，可以更好地了解鼻咽癌转移的进化史以及局部区域治疗对转移性鼻咽癌影响的机制。该研究为鼻咽癌转移的进化轨迹和特征提供了广泛的见解。描绘了鼻咽癌原发、区域淋巴结和转移性肿瘤的全面基因组图景。根据系统发育分析和scRNA-seq分析，观察到两种不同的远处转移的传播途径，包括区域淋巴结转移的淋巴传播和原发肿瘤的血行传播。通过淋巴途径的原发肿瘤在EMT、UV反应和血管生成等途径上显著富集，而通过血行途径的原发肿瘤在IFN-α和IFN-γ反应途径上显著富集。并成功地利用放射组学数据将鼻咽癌转移途径分为淋巴转移和血行转移。最后，在淋巴转移途径患者的治疗中加入局部区域放疗可改善生存结局，而血行途径患者则更多地受益于免疫治疗。
