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结直肠癌腹膜转移的分子特征
导读
在结直肠癌(CRC)患者中，有很多患者在病程中发生腹膜转移(PM)。PM与较差的生活质量和临床结局有关，所以为了改善对这一患者群体的护理，我们需要更好地了解CRC-PM的分子特征。在下文中，作者分析了52名CRC-PM患者的分子特征，证明CRC-PM代表了一个不同的CRC分子亚型CMS4，并可以进一步分为三个不同的类别，每个类别都有独特的特征。最后，作者定义了CRC-PM的进化特征，表明多克隆转移种植是这些病变的基础。总之，作者的研究结果表明，CRC-PM应被视为一种独特的疾病实体。
文章解读
作者在52例结直肠癌患者中，收集了82例新鲜冰冻腹膜转移标本和8例配对的原发癌标本。作者根据RNA转录图谱(图1A)，确定了单发(n=37)或多发腹膜病变(n=15)的CMS。虽然观察到CMS4样本之间具有转录异质性，但大多数腹膜转移病变被归类为CMS4 (图1A)。同一患者的多个样本之间的一致性很高，有13/15的多个样本的患者在所有病变中显示相同的分类(图1B)。作者将82.6%的腹膜转移患者归类为CMS4，而CMS1、CMS2、CMS3或混合型CMS的发生率要低得多(图1B)。与I-IV期原发结直肠癌标本相比，CMS4在CRC-PM组（转移标本）中高度富集(图1C)。这些结果表明，CMS4癌症经常伴有腹膜病变。同时在一组II期CRC原发肿瘤患者中，作者发现CMS4患者的腹膜转移发生率显著更高（图1D，E），佐证了这一观点。另外，作者对独立队列的原发结直肠癌和配对的PM组织进行CMS分类，进一步验证了这些发现。
对每个患者进行突变分析，作者发现CMS1分类与MSI（microsatellite instable）和BRAF-V600E突变密切相关(图1B)。其中4例MSI样本全部是CMS4亚型，并且全部来源于粘液性肿瘤(图1B)。CMS3患者的特征是Smad4突变，但在该类患者中没有检测到其他致癌突变。另外所有CMS2患者中均发现KRAS和TP53突变。作者还发现，在腹膜转移队列中，NRAS突变略少，而KRAS突变频率显著增加(图1F)，这高于最近报道的转移性结直肠癌中KRAS的突变频率。与上述结果一致，作者也在原发II期肿瘤(AMC-AJCCII-90)中检测到KRAS/BRAF的突变富集以及KRAS信号活性增加，这些肿瘤最终将复发为腹膜转移疾病。这些发现表明，KRAS的激活是腹膜扩散的预测因素。总之，在这里作者通过对CMS亚型的分析和突变分析描述了腹膜转移瘤组织的分子特征。
转移灶在CMS亚型之间表现出明显的形态差异，CMS2和CMS3的腺体结构整齐，CMS4样本的间质细胞增多，肿瘤细胞含量减少。虽然大多数腹膜病变位于覆盖肠道的腹膜或大网膜，但CMS2分类的腹膜病变主要来自卵巢，这表明CMS亚型在播种过程中具有特异性。与TCGA数据库中原发性结肠癌(COAD)队列相比，腹膜转移队列中的粘液性原发肿瘤显著富集。以前人们认为粘液腺癌类型以前与CMS4、MSI、RAS-MAPK通路突变、总体预后较差和腹膜转移频率增加有关。虽然在作者的腹膜转移队列中，粘液腺癌与MSI和RAS突变无关，但它与腹膜癌指数（PCI）相关。PCI评分与总生存率(OS)(图1G)和复发死亡率(RFS)密切相关。相比之下，转移性或同时性腹膜转移（在结直肠癌确诊时即发现的腹膜转移）患者之间的OS和RFS没有发现差异。RAS或BRAF突变不影响OS，然而，作者确实发现有少数RAS/BRAF野生型癌症患者表现出更差的RFS和显著增加的肿瘤负荷。由于非CMS4患者数量较少，作者没有发现PCI评分与CMS分型之间有统计学意义，但大多数患者的PCI评分较高，被归类为CMS4(图1H)。相应地，与CMS2、CMS3或混合CMS患者相比，CMS4患者表现出更差的OS(图1I)。
在本文中，能形成腹膜转移能力的细胞系被称为CMS4细胞系(图2A，B)。为了确定腹膜转移的决定因素，作者进行了差异基因表达分析，比较了在体内能和不能形成腹膜转移的CRC细胞系 (图2C) 。这项分析表明，MSN(膜组织延伸刺突蛋白)在形成和不形成腹膜转移的细胞系中表达差异最大(图2C)。MSN在腹膜转移患者的原发肿瘤(图2D)和CMS4原发CRCs (图2E)中的表达显著升高，这表明MSN在腹膜病变中的表达不增加，但在腹膜转移起源的原发癌中已经存在。患者腹膜转移组织的染色证实了大量MSN阳性的肿瘤细胞(图2F)。此外，与肝转移相比，MSN在腹膜转移中的表达也显著增加(图2G)。MSN蛋白在体内腹膜肿瘤的肿瘤边界表达最丰富，特别是在肿瘤细胞与周围组织相互作用的地方(图2H) 。在功能上，MSN参与了细胞与细胞外基质成分的黏附，因为MSN的敲除减少了播种后丝状足的形成和对胶原蛋白表面的黏附，并减少了3D生长(图2I-N) 。相反，MSN在CMS2细胞系中的异位表达导致了体外丝状足的形成，这再次强调了MSN在细胞附着中的作用。另外，MSN基因敲除导致体内腹膜转移减少(图2O-R)，而这不影响体外生长或体内皮下肿瘤生长速度。总之，这些数据表明在腹膜转移过程中需要CMS4相关MSN的表达。
腹膜转移的患者在进展率和症状上都表现出显著的临床差异。考虑到CMS4样本的转录谱中存在广泛异质性(图1A)，作者猜测可能存在多个CMS4亚簇。通过进一步的分析，作者发现了3个不同CMS4簇(CMS4-PM.A、B和C)，这三个亚簇具有不同分子和临床特征 (图3A)。与CMS4-PM.A相比，作者观察到CMS4-PM.C亚组更倾向于大网膜作为转移部位，而肿瘤细胞含量或原发肿瘤位置的没有显著差异(图3A)。突变分析显示，在CMS4-PM.A簇中KRAS突变显著富集，在CMS4-PM.B簇中TP53突变的频率相对较高(图3A，B)。在CMS4-PM.B簇中观察到KRAS和TP53的通路活性明显降低，而在该簇中发现的KRAS突变出现的频率较低，这表明在CMS4-PM.B簇中存在一种不同的、较少依赖KRAS的生物学机制(图3B，C)。进一步的基因集富集分析表明，在CMS4-PM.A(RAS突变亚型)中，氧化磷酸化、Myc和活性氧 (ROS)途径高表达。而CMS4-PM.B（粘液型）在DNA复制过程和E2F靶点上显著富集，KRAS和TP53信号评分比较低，并且具有粘液细胞类型特征(图3D)。CMS4-PM.C的上皮-间充质转化、转化生长因子-β、KRAS和免疫相关途径(炎症亚型)的表达水平最高(图3D)。Bulk-RNA测序的反卷积显示，除CMS1病变外， CMS4-PM.C簇的样本具有最高的免疫和基质细胞浸润(图3E)。免疫细胞的进一步去卷积表明，CMS4亚组之间的免疫细胞群组成也不同，CMS4-PM.B中髓系细胞的相对丰度较少(图3F)。在CMS4-PM.C(炎症亚型)样本中，PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM-3或TIGIT等免疫检查点抑制分子的基因表达上调，这表明这些肿瘤中存在免疫抑制微环境(图3G)。为CRC患者的治疗提供了新的研究思路。在临床上，CMS4-PM.B病变的患者表现出较高的PCI评分(图3H)，而与其他两个亚型相比，OS更差 (图3I)。
结直肠癌细胞种植后，会在腹膜表面发生腹膜转移。与内脏器官(如肝脏)的转移不同，腹膜没有预先存在的基质环境，比如器官内的成纤维细胞、免疫细胞和内皮细胞。。腹膜病变会吸引不同类型的细胞，但目前尚不清楚这种现象与原发性肿瘤部位的间质成分有何关系。为了解释这一现象，作者将来自同一患者的原发肿瘤和腹膜转移瘤进行配对研究。转录组分析显示匹配的一对之间具有高度相似性(图4A)。相反，肝转移瘤并未与其配对的原发性肿瘤反映出不同的微环境(图4B)。与原发性肿瘤相比，作者只有在一小部分腹膜转移样本中，观察到了CMS亚型的转换(图4C)，而在肝转移中CMS亚型的转换更为常见(图4D)。另外，转录组数据的去卷积证实原发性结直肠癌和腹膜转移瘤的上皮细胞、基质细胞和免疫细胞的组成高度保守(图4E，F)。接下来，作者对6例冰冻标本进行了单细胞转录组分析，其中包括1对配对的原发性结直肠癌和腹膜转移瘤。对26,570个细胞的聚类分析显示存在不同的细胞类型(图4G)。而不同患者的上皮细胞是分开聚类的，免疫和基质细胞类型按细胞类型聚类在一起，与患者来源无关(图4G)。配对的原发性肿瘤和腹膜转移瘤的上皮细胞明显聚集在一起，这表明上皮细胞在患者体内的相似性很高，而在患者间显示出高度的异质性(图4H)。总之，在CRCs中，腹膜转移瘤囊括了原发癌的表型和细胞组成。
拷贝数变异(CNV)分析表明，在TCGA数据库中，腹膜和肝脏转移瘤的获得/丢失频率分布与CRCs高度相似。然而，通过分析单个CNV图谱，作者发现腹膜和肝脏转移瘤样本之间有一些显著的差异。首先，与出现肝转移的患者相比，原发性肿瘤和腹膜转移瘤的CNV都要低得多(图4I)。同样，与肝转移患者相比，原发性结直肠癌和转移癌患者的拷贝数异质性(CNH)显著低且更稳定。直接比较转移瘤和配对的原发性结直肠癌CNV特征，作者发现与肝转移瘤相比，腹膜病变与其原发性肿瘤更相似(图4J)。另外，作者通过对配对的原发癌和腹膜转移瘤的单细胞CNV分析证实原发癌和腹膜转移瘤之间具有高度保守的CNV图谱和克隆异质性(图4K)。总体而言，这些发现表明，与肝脏相比，腹膜转移是一个独特的、CMS4特异性的转移过程，腹膜转移瘤保留了原发肿瘤的克隆异质性和转录特征(图4L)。
全文总结
本篇文章对CRC衍生的PM队列进行分子表征，发现其主要分子亚型是CMS4，并且富含KRAS突变。CMS4亚型进一步能够细分为具有不同特征的三个亚组。与CMS4相关的结构蛋白Moesin在腹膜播散中起着关键作用。此外，作者还定义了CRC-PM的特定进化特征，表明这些病变由多克隆转移性播种造成。因此，作者认为，CRC-PM应被视为一种独特的疾病实体。
参考文献
1. Lenos KJ, Bach S, Ferreira Moreno L, et al. Molecular characterization of colorectal cancer related peritoneal metastatic disease. Nat Commun 2022; 13(1): 4443.
