各位小伙伴们大家好呀，癌症研究大家可能已经见多识广啦。今天小编给大家带来发表在Cell Discovery(IF=38.079)上的一篇关于癌症并发症的单细胞研究。作者对于癌症相关恶病质这一临床问题通过单细胞和实验进行了详细的剖析，快来和小编一起看看吧！

一.研究背景

癌症相关恶病质(cancer-associated cachexia,CAC)是一种病因复杂的综合征，其特征是骨骼肌和脂肪组织的显著耗竭。CAC患者通常表现为食物摄入减少、能量消耗升高、分解代谢过剩和系统性炎症。CAC的发生会增加患者死亡率并降低生活质量以及放疗化疗的疗效。

白色脂肪组织(white adipose tissues,WAT)由不同的细胞成分组成。除脂肪细胞和脂肪干祖细胞(ASPCs)外，WAT中还存在内皮细胞、平滑肌细胞以及多种类型的常驻和浸润的免疫细胞。总之，这些细胞调节脂肪微环境，并在代谢紊乱的发生发展中起重要作用。于是作者通过分析来自有或没有CAC的个体的内脏和皮下库的人脂肪组织的单细胞表达谱，描述了与恶病质发展相关的不同细胞类型和/或不同储存库的特异性，揭示了对恶病质的储存库特异性和疾病特异性细胞反应以及导致CAC脂肪组织消耗的细胞免疫反应改变。

二.主要结果

1.脂肪组织中非脂肪细胞部分细胞群的鉴定

作者对8例胃癌患者(4例非恶病质、4例恶病质)的SAT和VAT脂肪样本的间质血管组分(SVFs)进行了单细胞RNA测序(scRNA- seq)。经过质量控制，最终保留33856个细胞进行下游分析；经过聚类及标记基因注释(图1b)分为9个主要的细胞群(图1a)。作者观察到：恶病质组和非恶病质组不同细胞类型的分布在VAT和SAT上无明显差异；但是，VAT和SAT不同细胞类型的百分比有明显的差异，VAT中有更多的免疫浸润(图1c、d)；SAT中含有较多的血管细胞，与观察到的SAT血管化良好一致。CAC患者SVF中免疫细胞比例明显高于VAT(图1d)。

2.在VAT和SAT中鉴定出不同的祖细胞群

在这一部分，作者对VAT和SAT中的祖细胞群进行了详细分析。经过分析，作者将脂肪干细胞和祖细胞(adipose stem and progenitor cells, ASPCs)聚类为12簇，每一簇均表达高水平的CD34、FDGFRA和THY1(图2a)。表达高水平MGP、CXCL14、APOD被注释为成脂祖细胞；高表达FMO2基因的簇主要分布在VAT中，因此被标记为内脏前脂肪细胞(vPreA)；高表达FABP4和APOE的簇表明更倾向于成为成熟的脂肪细胞，被标记为皮下前脂肪细胞(sPreA)；除此之外，作者还注释发现了成纤维细胞、造血干细胞(HSC)以及炎症祖细胞(inflammatory progenitor cells)（图2a）。

对SAT中脂肪生成祖细胞的轨迹分析发现了两种不同的转变，即从ASC开始向sPreA或vPreA和成纤维细胞的转变，这表明了sPreA和vPreA在脂肪生成中的内在区别是由分叉的发育轨迹决定的(图2b)。然后，作者通过GO分析显示，与VAT相比，SAT的前脂肪细胞线粒体功能和脂肪酸代谢增强(图2c)。通路富集分析也显示，SAT中PPAR信号通路活性较高，表现为FABP4、FABP5、ANGPTl4、LPL和CD36的表达相对较高，与SAT中大多数祖细胞为前脂肪细胞的观察结果一致(图2d、e)。

3.SAT和VAT中脂肪祖细胞的恶病质特异性改变

作者进一步分析了恶病质和非恶病质患者在不同脂肪储存库(SAT和VAT)中可能的祖细胞变化(图3a)。作者观察到，与无恶病质的患者相比，在恶病质组的vPreA中，主要调节脂肪细胞分化的基因，包括CEBPB,CEBPD,BMP2和KLF4明显降低(图3b、c)。此外，簇10被标记为ITLN1和MSLN特异性表达的间皮源性祖细胞，几乎只在非恶病质患者的VAT中发现(图3d)。作者进一步对簇8(也被称为炎症祖细胞)中上调的基因进行功能分析发现，趋化因子信号通路、NOD样受体信号通路、补体和凝血级联显著富集，提示炎症反应被激活(图3e)。

作者假设SAT中恶病质特异性炎症祖细胞的发生可能是由肿瘤衍生因子引起的，通过scRNA-seq数据鉴定的标记基因，包括CCL2,CXCL2,TNFAIP6和TNFRSF12A表明肿瘤细胞将脂肪生成祖细胞转化为炎症祖细胞，证明其假设。进一步，作者通过细胞系实验也得到了相同的结论(图3f)。这些结果表明，肿瘤细胞分泌的某些蛋白质至少部分地促进了祖细胞中活化的趋化因子基因表达，特别是在恶病质患者中。

4.巨噬细胞在恶病质患者中表现为促炎转变，并可能加重脂肪消耗

髓系细胞对恶病质的影响仍不确定。因此，作者对脂肪组织中的巨噬细胞进行了详细的分析。基于巨噬细胞的marker基因，作者鉴定了三种具有独特高表达基因的不同亚型，并推断了它们潜在的病理生理功能：存在于各种组织中，高表达LYVE1、SELENOP以及CD163的血管周围巨噬细胞(PVM)；特征为MHC-Ⅱ的高表达和低表达LYVE1类似于巨噬细胞的一种亚型，作者定义为非血管周围巨噬细胞(NPVM)；以及主要在VAT中检测到的脂质相关巨噬细胞(LAM)。

作者发现CAC组两库(SAT和VAT)的脂肪组织巨噬细胞(ATM)占免疫细胞的比例均降低(图4a)。接下来通过结肠腺癌小鼠模型作者发现，在恶病质条件下，VAT中巨噬细胞的比例明显下降，而SAT中巨噬细胞的比例没有下降，与scRNA测序结果一致(图4b)；此外，作者还发现附睾WAT(epididymal white adipose tissues,eWAT)的重量与脂肪组织中巨噬细胞的丰度呈正相关(图4c)。如图4d所示，脂代谢相关基因，如CEBPD和ACSL1，在无CAC患者的巨噬细胞中表达上调的基因中富集。进一步的实验分析表明，在CAC发展过程中，巨噬细胞清除后，eWAT的体重下降显著减少，脂肪组织重量更重，脂肪细胞更大(图4e-i)。此外，在氯磷酸二钠脂质体处理的小鼠脂肪组织中，脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)的表达和激素敏感性脂肪酶(HSL)的磷酸化均降低，这表明在eWAT中脂肪分解的活化程度较低(图4j、k)。在这个过程中作者还发现，IFN-γ的mRNA和蛋白表达水平在恶病质发展时增加，在氯磷酸二钠脂质体处理后恢复到基础水平(图4l、m)。最终，作者得出结论：在恶病质发展过程中，VAT中巨噬细胞的促炎转化可能显著促进脂肪丢失。

5.CD8+T细胞在恶病质患者的VAT中也表现出促炎特征和增强的细胞溶解效应活性

在这一部分，作者对淋巴系细胞进行分析。脂肪组织中的免疫细胞主要由T/NK细胞组成，作者对T/NK细胞进行了重新聚类注释(图5a、b)。如图5c、d所示，大部分的T细胞都来源于VAT，于是作者重点关注了CAC期间VAT中的免疫微环境改变。

接下来，作者使用Monocle推断状态轨迹，探索了CD8+T细胞的动态免疫状态和细胞转移(图6a)。具有较高细胞毒性分数的TEMRA出现在轨迹分支的一端，TRM出现在中间状态，终止于激活的TEM(图6a)；CAC组的CD8+T细胞出现在较晚的阶段(图6b)，表明其具有活化性质。差异基因表达分析显示，在恶病质患者中，代表活化状态的基因表达显著升高；与非恶病质患者效应记忆性CD8+T细胞比例较高一致，与功能失调表型和失活状态相关的基因如MT1X、MT1E、IL7R和ZFP36L2在非恶病质患者CD8+T细胞中高表达(图6c)。

为了进一步证实在CAC发展过程中，更多高细胞毒性的活化CD8+T细胞浸润到脂肪组织中，作者收集了另外8例接受手术治疗的胃癌患者的脂肪组织，通过免疫组织化学染色对GZMB+细胞进行了染色(图6d)。作者发现染色GZMB+细胞的数量与脂肪细胞的大小有很强的相关性(图6e)，提示由癌症相关因素触发的脂肪组织局部组织分解代谢与细胞毒性T细胞浸润之间的存在一定的关联。通过对食管癌或胃癌的bulk RNA-seq数据反卷积分析，作者推断体重减轻患者的VAT中细胞毒性CD8+T细胞的百分比增加(图6f)。图6g显示，恶病质患者脂肪组织SVF中多种细胞类型的TNF和TNFSF12表达普遍增加，而这些SVF细胞中IL6或IL1B的表达没有显著增加，这表明成熟脂肪细胞可能是主要来源。

体外共培养成熟脂肪细胞和活化的原代CD8+T细胞实验发现，共培养一天后脂肪细胞中脂滴的大小显著减少，培养上清液中甘油的浓度增加，表明脂肪的溶脂作用增强(图6h-j)；脂肪细胞中HSL磷酸化水平也一致升高(图6k、l)。综上这些结果，作者提出结论：活化的CD8+T细胞在体外对脂肪细胞具有促进分解代谢的功能；在恶病质发展过程中，活化的CD8+T细胞可能通过产生更多的IFN-γ，促进脂肪分解代谢。

6.细胞相互作用分析预测了恶病质中人类WAT相互作用组的重塑

由于VAT中某些免疫细胞类型的结构和功能表型的显著变化，作者在这一部分探索激活状态的这种转变在多大程度上影响细胞通信。基于CellPhoneDB分析，作者发现：在CAC的的背景下，免疫细胞之间的配体受体对数量较多, 尤其是涉及巨噬细胞的(图7a)。进一步作者使用Connectome web分析来揭示CAC过程中巨噬细胞的潜在靶细胞，分析显示巨噬细胞与单核细胞和cDC2Bs具有相似的连通性(图7b)；进一步作者提取了CAC过程中与CD8+T细胞的高表达相互作用，揭示了与巨噬细胞的潜在相互作用(图7c)。综上结果，在恶病质患者的脂肪组织中发生着细胞相互作用的急剧重塑，包括脂肪祖细胞、巨噬细胞、CD8+T细胞等。

至此，这篇文章就介绍完啦。总结起来，这篇文章基于癌症相关恶病质(CAC)这个临床上较为严重的综合征，通过对皮下脂肪组织(SAT)和内脏脂肪组织(VAT)的单细胞测序分析以及多种实验分析，描绘了恶病质发展相关的不同细胞类型和/或不同脂肪储存库的特异性以及细胞反应，揭示了导致CAC脂肪组织消耗的细胞免疫反应改变。这为理解CAC的发生以及临床治疗方法的开发提供了帮助。纵观全篇，生信分析都是基础的单细胞分析，小编觉得这篇文章最大的亮点在于实验与生信分析的完美结合以及每个结果对所研究问题的环环相扣，这些非常值得我们学习！