扫码联系客服
各位小伙伴大家好呀，今天小编给大家带来今年1月份发表在Nature communications(IF=17.694)上的一篇关于T细胞耗竭的研究，z作者绘制了详细的乳腺癌T细胞耗竭相关的免疫微环境图谱，生物学知识丰富，快来一起学习一下吧！
一.研究背景
免疫检查点阻断疗法改善了许多癌症患者的预后，在乳腺癌中的应用仍然局限于三阴性患者，且大多数患者不能获得长期的临床获益。以前认为是由于免疫原性差，但一些研究已经确定了免疫浸润对乳腺癌进展的强烈影响。在靶细胞清除失败且T细胞受体(TCR)信号持续存在的慢性炎症部位，T细胞可能变得“耗竭”，这是一种以抑制性检查点受体(如PD-1、CTLA-4、TIM-3和LAG-3)共表达升高为特征的细胞状态；但最近的研究表明，耗竭性T细胞仍可能在人类肿瘤中增殖，但这些细胞在多大程度上保留其抗肿瘤功能尚不清楚。于是作者使用单细胞转录组学(scRNA-seq)结合成像质谱流式(IMC)分析系统地研究了含有或不含有耗竭T细胞的人类乳腺肿瘤的免疫环境，重点关注了管腔(luminal)亚型。描述了衰竭相关的肿瘤免疫微环境(TIME)特征，这有助于发现新的治疗靶点，并提出PD-1、CXCL13和MHC-I作为患者分层的新biomarker组合。
二.主要结果
1.乳腺肿瘤免疫环境的单细胞图谱
为了系统地研究乳腺癌肿瘤免疫微环境(TIME)，作者对14例免疫浸润性乳腺肿瘤进行了scRNA-seq(图1a)。基于作者之前的研究，根据肿瘤和免疫细胞的共同模式对肿瘤患者进行了分组，作者发现一半的样本含有耗竭T细胞(例如PD-1high/CTLA-4high/CD38highT cells)，于是将其称为耗竭环境(IE1)；另一半主要含有不表达衰竭标记的T细胞，称为非耗竭环境(IE2)。经过质量控制，作者保留了119000个高质量的细胞(图1b、c)，基于已知的marker基因表达情况，手动注释了主要的细胞类型(图1d、e)。作者观察到IE1和IE2肿瘤的主要细胞类型在频率上没有显著差异(图1f)，尽管不同的T细胞表型导致了IE1和IE2之间的区别，但两组的整体T细胞频率是相似的。
为了验证基于scRNA-seq数据的发现，作者对14个测序样本保留的12个FFPE样本进行了IMC分析。对每一个panel分析共获得了77个感兴趣区域(ROIs)(图1g)，经过数据预处理和细胞分割，每个panel有超过40万个单细胞，对于细胞数量相似的连续切片，作者手动匹配了ROI，并且根据平均marker表达进行了基于图聚类，识别了存在的细胞类型(图1h)；除在scRNA-seq数据集中鉴定的所有细胞类型外，作者在IMC数据中还鉴定到了中性粒细胞，但中性粒细胞通常很少，且在IE1样本中出现的频率略高于IE2样本。
2. PD-1high/CTLA-4high T细胞具有增殖能力，表达肿瘤反应性标志物，并与肿瘤细胞中MHC-I的高表达相一致
为了进一步探究这些肿瘤中T细胞的功能状态，作者分析了各个T细胞亚型的转录组数据，并且加入了NK细胞，因为其与T细胞具有转录和功能相似性，据报道也可能发生耗竭。作者首先使用伪bulk(pseudobulk)的方法进行分析，如图2a所示，IE1中PDCD1、CD276和分别编码免疫检查点受体PD-1、B7-H3和TIM-3的HAVCR2表达水平高于IE2，这与之前的细胞计数结果一致；如MKI67、GZMB等与T细胞激活相关的基因IE1的表达水平也高于IE2。此外，编码三种转录因子(IRF4,BATF4和TOX)的mRNA表达水平在IE1的T和NK细胞中也明显高于IE2(图2b)，这与TCR信号通路的强弱相关。最后，作者发现IE1的T细胞和NK细胞中细胞因子和细胞因子受体的表达普遍高于IE2，其中CCL3、CXCR6、CSF1和IL13的差异最为显著，这些细胞因子和细胞因子受体都在炎症信号传导中起作用(图2c)。
为了比较在IE1和IE2免疫环境中T和NK细胞表型的组成，并确定哪些细胞类型具有丰度变化，作者对上两种细胞类型的scRNA-seq数据进行了重聚类并注释了细胞亚型(图2d-f)。高表达衰竭标志物CD8+耗竭T细胞簇、两个高表达PDCD1的CD4high细胞簇，已知的T滤泡辅助(Tfh)、一个NKT细胞簇在IE1中富集(图2e、f)，毒性细胞簇在IE2微环境中富集。
接下来，作者更详细地探讨了衰竭相关的表型T细胞状态。有研究将T细胞耗竭状态描述为一个连续的过程，在此过程中，自我更新的祖细胞表达转录因子TCF7，然后随着衰竭的增加和增殖潜力的降低而逐渐消失。作者观察到IE1中TCF7 mRNA的表达减少(图2b)，特别是在IE1富集的T-CD8耗尽的簇。与IE2相比，IE1环境也富含增殖T细胞(图2e)。T增殖细胞簇在所有肿瘤反应性和衰竭相关样本中也富集，与非增殖细胞相比，TCF7的含量较低(图2h)。这些结果表明表达衰竭特征的毒性T淋巴细胞(CTLs)也表达肿瘤反应特征和增殖标志物。
作者进一步研究了IE1和IE2中CD8+T细胞激活差异的潜在来源。伪bulk分析显示，与IE2的肿瘤相比，IE1的肿瘤上皮细胞中MHC-I编码基因的表达显著高于IE2的肿瘤，这在IMC分析中更为明显(图2i)。作者分析表明，MHC I类表达构成了IE1和IE2肿瘤细胞之间的主要差异，MHC-I比PD-L1与CD8+T细胞活化更相关。作者在IMC分析中发现，CXCL13在IE1中的表达在转录和蛋白水平上均得到证实(图2j, k)，并且通过scRNA-seq和IMC检测到的CXCL13+T细胞在同一肿瘤的两个独立片段上的比例高度相关。综上所述，这些发现表明，在免疫环境衰竭的肿瘤中，T细胞具有增殖能力，显示出肿瘤反应特征，尽管有最终衰竭的迹象，但可能比免疫环境未衰竭的肿瘤中的T细胞保留更多的抗肿瘤活性。
3. 在衰竭的免疫环境中细胞毒性潜能被改变，但没有消除
在这一部分，作者研究了两种免疫环境在T细胞和NK细胞的细胞毒性潜能方面的差异。对IE1和IE2样本中9个选定基因进行伪bulk比较，结果显示，在IE2 T细胞和NK细胞中唯一显著升高的细胞毒性分子是TNF，而GZMB、GNLY和FASL在IE1中表达水平较高(图3a)。GZMB和FASL在T-CD8耗竭的簇中表达最高(图3b)，这表明尽管这些T细胞的表型是耗竭，但它们仍具有发挥细胞溶解效应功能的潜力。
为了进一步评估IE1和IE2之间的细胞毒性潜能差异，作者对CD8+T细胞进行了伪时序分析。结果显示，一端是naïve T细胞，另一端是耗尽的T细胞，中间是细胞毒性簇(图3c、d)，且IE1样本的平均伪时间分数更高(图3e)，支持免疫耗竭是一个连续统的概念。作者发现在细胞毒性基因中，IFNG和TNF早期升高，其次是GZMB(图3f)。
为了更好地理解NKT细胞如何作用于IE1环境，作者更详细地分析了它们的表达谱。CSF1是NKT细胞簇中少数几个独特的过表达基因之一(图3g)，它编码一种对髓系细胞的活化和分化很重要的细胞因子。因此，T细胞和NK细胞介导的细胞毒性的主要效应物在两种免疫环境中是不同的。NKT细胞在耗竭T细胞富集的免疫环境中表达CSF1可能代表了T细胞活性和髓细胞介导的免疫反应之间的联系。
4. 免疫耗竭环境中的髓系细胞表明炎症增加
于是在这一部分，作者分析了IE1和IE2中的髓系细胞亚群。对髓系细胞(单核细胞，巨噬细胞和树突状细胞，不包括粒细胞)的伪bulk分析(图4a)显示，IE1中几个细胞因子的编码mRNA过表达，最显著的是CCL18，它之前被认为与乳腺癌转移相关。对髓系细胞scRNA-seq数据进行重聚类共注释出单核细胞(mono)或早期分化的巨噬细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)、树突细胞(DCs)和增殖的髓系细胞(图4b)，大多数单核细胞和TAM簇在IE1肿瘤中更常见(图4c)，而IE2肿瘤显示TAM-2簇和经典2型DCs富集。mono-1细胞簇表现出单核细胞特异性的基因标签，而mono-2细胞簇表现出与多个TAM细胞簇重叠的模式，可能代表单核细胞向成熟巨噬细胞的转变表型(图4d)。
作者接下来研究了T细胞和髓系细胞间的相互作用关系。作者从文献中收集到两组基因signature定量分析了髓系细胞吸引T细胞和抑制T细胞的特性。两个signature在单细胞水平、患者水平和表型簇水平均显示出正相关(图4e)，提示具有强抑制潜能的髓系细胞也可能主动吸引T细胞。作者还观察到DC中T细胞抑制的标志物表达，与其他DC相比，migDC簇表现出特别强的T细胞抑制特征(图4e)，具体体现在肿瘤组织中，migDC的PD-L1编码蛋白CD274的表达水平最高；轨迹推断分析(Slingshot)提示cDC2s向migDCs过渡，与之前的研究一致(图4g)。作者还观察到在cDC2-migDC的转变过程中，不同的migDC标记物如CCL17,CCL22,CCL19的表达变化(图4h)。综上，有或无耗竭T细胞富集的免疫环境中存在炎症状态不同的髓系细胞。
5. 免疫状态与不同的细胞间通讯模式有关
在这一部分，作者系统地研究了IE1和IE2免疫环境中的细胞相互作用差异。首先作者量化了所有样本中每个细胞类型对的预测配体受体对(LR)相互作用的总数(图5a)，揭示了许多预测的成纤维细胞和内皮细胞之间的相互作用，以及髓系细胞的自相互作用。
接下来，作者比较了有和无T细胞耗竭的乳腺肿瘤免疫环境中预测的相互作用，发现了大量富集于IE1或IE2肿瘤的预测LR对(图5b)。为了研究特定的髓系细胞、T细胞和NK细胞亚型之间如何相互作用，作者关注这些亚型的交互作用分析(图5c)，为了更好的生物学解释，作者首先将已识别的cluster聚合成更大的metacluster，每个metacluster代表一个特定的细胞亚型；结果显示所有T细胞、NK细胞和髓系metacluster都有300到600个预测相互作用，其中TAM自相互作用最为频繁。
然后，作者使用NicheNet预测哪些髓系衍生配体与T细胞耗竭联系最密切。最能预测耗竭相关基因表达的髓系来源配体是IL15，其次是IL1B和CXCL16(图5d)，这与IE1和IE2肿瘤中IL15-IL15受体相互作用的富集的结果一致。总之，作者预测了T细胞与其他细胞的相互作用，并且表明在耗竭型T细胞高的免疫环境中，细胞因子和趋化因子信号传导增强，特别是髓系细胞与T和NK细胞。
6. 免疫细胞的空间分布随耗竭而变化
LR分析可以预测细胞间的通信，但它对细胞空间的信息是盲目的。因此，作者使用IMC数据来研究预测的相互作用的细胞是否在空间上也是邻近的，以及IE1和IE2的空间模式是否不同。作者使用成对邻域分析来量化每个细胞类型对的相对排斥或相互作用，发现成纤维细胞和内皮细胞在彼此的邻域内高度富集(图6a)，与预测的LR相互作用相一致。总体而言，与PD-1低表达的T细胞相比，PD-1high T细胞至少有一个migDC作为其直接邻近细胞(图6b、c)。作者进一步量化了不同T细胞亚型的近邻的细胞类型组成，结果表明，与PD-1lowT细胞和Tregs相比，平均而言，PD-1highT细胞被较少的髓系细胞和成纤维细胞包围，但被更多的其他PD-1highT细胞、pDC和migDCs包围(图6d)。
为了确定这些细胞因子周围的细胞类型，作者定义了细胞因子周围30μm范围内的所有细胞，并将这些细胞因子中的细胞类型与整个组织进行了比较(图6e)，作者发现CD4+T细胞在CXCL9、CCL22和CXCL13环境下富集，而CD8+T细胞在CXCL9和CXCL10环境下富集最高；B细胞在CXCL13环境中显著富集，migDC在CCL17和CCL22环境中显著富集，而髓系细胞在CCL18环境中显著富集(图6f)。作者进一步对原始样本进行了免疫荧光玻片扫描，该方法可以直接检测三级淋巴结构(TLS)，作者发现密集的成熟TLS在IE2分类的肿瘤中更常见，而不成熟TLS在IE1分类的肿瘤中更常见(图6g)。虽然CXCL13+T细胞在TLS形成中也起作用，但CXCL13+T细胞的空间分布在包含成熟TLS和不成熟TLS的图像之间发生了变化(图6h)。
总之，空间分析与主要预测的细胞间相互作用一致，并揭示了细胞因子表达细胞的空间聚集在IE1肿瘤中频繁出现。且migDC介导的T细胞活性调节是通过直接相互作用发生的，优先发生在或接近成熟和不成熟TLS区域，并且CXCL13+T细胞在不同免疫环境的肿瘤中空间分布上存在差异。
至此这篇文章就介绍完啦，总结一下：作者首先将乳腺癌的肿瘤免疫微环境根据是否富集耗竭性T细胞分为了两类；第二步详细的研究了耗竭型和非耗竭型肿瘤中的T细胞功能差异，证明了免疫环境衰竭的肿瘤中，T细胞具有增殖能力，显示出肿瘤反应特征；第三步由于T细胞活性和髓细胞介导的免疫反应之间的存在联系，作者对髓系细胞与T细胞间的相互作用进行了详细的探讨；最后，基于预测的配体受体对以及IMC的分析验证了作者的结论，即在耗竭型T细胞高的免疫环境中，细胞因子和趋化因子信号传导增强，特别是髓系细胞与T和NK细胞。
这篇文章在小编看来有几大两点：第一是T细胞耗竭这个近年来的热点分析；第二是配对的单细胞测序数据以及FFPE样本的IMC分析及其具有说服力；第三便是作者的写作，强烈建议大家去拜读一下原文，完全可以当做一本关于T细胞耗竭的生物书来看。T细胞耗竭这个热点，屏幕前的你还不速速学起来，下一篇NC就是你哦！
