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自然界几乎所有的真核生物都含有多条染色体（除了雄蚁Myrmecia pilosula只含有1条染色体之外），然而染色体的数量与生物体功能之间的关系似乎没有一个明确的规律，比如在哺乳动物中，人类二倍体细胞中含有46条染色体，而印度麂二倍体细胞中则含有最低数量的染色体（雌性有6条，雄性有7条）。在单细胞真核生物中，酿酒酵母含有16条染色体（基因组大小~12Mb），而裂殖酵母只有3条染色体（~14Mb）。那么对于同一个真核细胞，含有多条染色体是否比只含有单条染色体更加有生存优势呢？这至今仍然是个谜。
中科院上海植生所覃重军研究团队提出了一个大胆的想法，将酿酒酵母的16条染色体通过人工改造，逐步融合为1条染色体，用以探索只含1条染色体的酿酒酵母是否能够生存，是否能完成有性生殖。与武汉菲沙基因信息有限公司合作，使用PacBio三代测序组装出了酿酒酵母基因组序列完成图，并从三维基因组方向分析了酵母中染色体三维结构及基因互作所经历的变化，这一重大成果于2018年8月1日以“Creating a functional single chromosome yeast”为题发表在Nature主刊。
【文章解读】
论文摘要：
真核生物通常具有多条染色体，本研究中我们以含有16条染色体的酿酒酵母为出发菌株，通过连续的染色体末端融合和着丝粒删除，创造出了只含有一条功能性染色体的酵母。通过Hi-C技术发现，16条线性染色体融合为1条之后，染色质的三维结构发生了巨大的变化，主要表现为所有的着丝粒、绝大部分端粒相关的染色质之间的互作和67%的染色质内的互作均消失了。有意思的是，单条染色体的酵母和野生型酵母的转录组和表型几乎是一样的。当与野生型酵母细胞共培养时，虽然单染色体酵母的生长竞争力减弱，但不同配型细胞之间仍能够交配并进行有丝分裂，只是孢子存活率稍微减少。这一合成生物学研究为探索真核生物的染色质结构和功能进化提供了新的见解。
研究思路：
1. 单染色体酵母SY14的设计和验证
2. 运用Hi-C技术分析4种酵母菌株的染色体构象变化
1）BY4742（16条染色体）
2）SY6（含9条染色体，包括7条融合的和2条自然的染色体）
3）SY13（只含有2条已融合的大染色体）
4）SY14（已全部融合的1条染色体）
3. 单染色体酵母与出发菌株的转录组和表型分析
主要结果：
（1）单染色体酵母的设计
使用CRISPR-Cas9精确敲除15个着丝粒和30个端粒，使染色体末端-末端连接（染色体融合的顺序是随机选择的），并避免影响邻近基因，只保留最后一条染色体中部的着丝粒以平衡染色体的两条臂，此外，19个端粒相关的长重复序列（>2kb）也被敲除了，以避免在未预期的位点发生潜在的同源重组，最终形成单染色体酵母菌株SY14。
（2）验证改造菌株的正确性
1）脉冲场电泳（PFGE）检测染色体数目和大小；
2）使用southern杂交（特异性端粒探针）检测了每轮融合后相应端粒的消失，并使用myc抗体检测13-myc-tagged端粒结合蛋白Sir2的信号减少（野生酵母中32个端粒聚集在6~8个位点，在SY14中只观察到1~2个端粒信号）；
3）通过Nop1蛋白的染色观察到细胞核结构的完整性；
4）使用PacBio测序SY14菌株和出发菌株BY4742，分别从头组装为1条和16条染色体，两者的基因组序列表现出很好的共线性，进一步确定了染色体融合是按照既定设计完成的。
（3）Hi-C揭示改造菌株的染色体构象变化
4种酿酒酵母菌株的Hi-C：
1）BY4742（16条染色体）
2）SY6（含9条染色体，包括7条融合的和2条自然的染色体）
3）SY13（只含有2条已融合的大染色体）
4）SY14（已全部融合的1条染色体）
染色体的互作网络和三维结构发生了逐步的变化，从互作谱图中可以看出，这4种菌株表现出了相对独立和明显的染色体内互作block，分别对应了16、9、2、1条染色体数目。
通过差减互作图谱分析发现，与BY4742菌株比较，染色体融合后的菌株其染色体间的互作随着着丝粒的减少而相应的逐渐消失，剩下的着丝粒间的互作则逐渐增强，许多染色体内的互作仍然是相似的。
BY4742和SY6的染色体表现出典型的Rabl结构，即着丝粒聚集在纺锤极体，端粒聚集在核膜，染色体臂则位于这两端之间。由于着丝粒和端粒数量的减少，SY13和SY14染色体表现出了相对圆形的结构，着丝粒和端粒位于整体结构的表面，染色体臂则急剧弯曲和压缩，这可能是由于受限于细胞核的大小。有意思的是，SY6中未融合的染色体与BY4742中对应染色体的结构只发生了轻微的变化，随着融合的积累，染色体结构逐渐变得压缩紧致，由“V”形变为了球形。
BY4742中大部分染色体间的显著互作在SY13和SY14中消失了，但超过33%的染色体内的互作在SY14中保留了，每条染色体的总体方向偏好性在4种菌株中是相类似的。
（4）单染色体酵母与出发菌株的转录组数据表现出很小的差异
BY4742和SY14的转录组数据结果差异很小，只有28个基因发生差异表达，只占6340个基因的0.4% 。邻近端粒的基因由于端粒的敲除，则可能会解除其表达受抑制情况，相应的，SY14中7个邻近已敲除端粒序列的基因表达上调，5个邻近保留端粒序列的基因表达下调。此外，8个与压力应答（尤其是DNA复制）相关的基因在SY14中均表达上调，表明这种大的单染色体可能诱导产生了新的染色体复制压力。
（5）表型分析（生长速度、生长竞争性、产孢子繁殖能力）
当在完全培养基（YPD、YC、YPG）上生长时，SY14只表现出了轻微的生长适应性减弱，且对毒性化学腐草霉素（Phl）的敏感性增加，对甲磺酸甲酯（MMS）和喜树碱（CPT）的敏感性不变。表型微阵列Phenotype microarray (PM)分析结果表明SY14与BY4742在所测试条件下的生长状态是类似的，这些测试条件包括不同的碳源、渗透物质和PH，仅在一些氮源条件下表现出轻微的生长减弱。
SY14的细胞大小和形态，以及细胞周期的进程均与BY4742类似，只是生长速率稍微减慢。通过共培养SY14与BY4742，监测其生长速率，以评估单染色体酵母是否能与多染色体酵母竞争生长。结果发现，随着共培养时间的增加，SY14细胞的数量快速减少，BY4742细胞逐渐占据主要群体，表明单染色体酵母细胞的生长适应性减弱了。
SY14能够产孢子，但孢子存活率降低，由BY4742的98%降低到87.5%。此外，SY6和SY13的产孢子存活率分别为96.5%、93%，这说明孢子存活率随着染色体融合的增多而呈现降低的趋势。
Discussion
在本研究中，我们首次在实验室创造出了只含有一条线性染色体且具有生物学功能的真核生物，这一合成的“健康”的酿酒酵母表现出了一些有意思的特征。根据之前的研究，染色体在细胞核内的定位和染色体间的互作会影响基因的表达，而在本研究中，与BY4742相比，SY14中大部分染色体间的互作消失了，染色体的整体三维结构也发生了较大的变化，但两者在各方面的表现相类似，这一结果首次表明酵母中染色体间的互作对全局性基因转录的影响较小。然而，一些与压力应答相关的基因，尤其是DNA复制压力，在SY14中表达上调，这可能是因为染色体臂的变长增加了复制相关的拓扑学压力。
酿酒酵母不仅是真核模式生物，也是用于生产能源和化工用品的细胞工厂，本研究为后续关于真核生物染色体结构和功能的研究提供了新的方法，我们创造的一系列染色体融合菌株为后续深入研究端粒和着丝粒生物学功能、减数分裂重组、核组织与功能的关系等提供了重要价值。
【后记】
文章第一作者为中科院植生所邵洋洋博士，通讯作者为赵国屏院士、周金秋、薛小莉和覃重军研究员。
菲沙基因在此研究中承担了酵母基因组的三代测序及组装和三维基因组实验及分析工作，感谢军事医学研究院赵志虎研究员对Hi-C及部分RNA-seq实验设计及数据分析的指导。再次恭喜覃老师研究团队，也为三代测序和三维基因组学研究领跑者-菲沙基因点个大赞！
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