癌症免疫治疗的目的是激活抗原特异性T细胞,以促进其抗肿瘤活性。例如,免疫检查点抑制剂的阻断疗法改善了很多实体瘤如肺癌、肾癌等患者的预后。但是实际上,已有文献报道并不是所有的T细胞群体都会被免疫检查点抑制剂激活,只有一小部分T细胞对PD1/PD-L1抑制剂敏感。今天给大家分享一篇2022年4月12日发表在Cancer Cell(IF:31.743)上,前体组织驻留记忆T细胞控制卵巢癌的免疫原性的文章。接下来让我们一起看看这一小部分前体组织驻留记忆T细胞具有怎样特异的功能以及怎样调控卵巢癌的免疫原性的呢?
Ovarian cancer immunogenicity is governed by a narrow subset of progenitor tissue-resident memory T cells
前体组织驻留记忆T细胞控制卵巢癌的免疫原性
一.研究背景
癌症免疫治疗的目标是重新激活抗原特异性T细胞,以促进其抗肿瘤活性。而肿瘤使得了活化以及未活化的T细胞呈现出代谢障碍,免疫检查点抑制剂阻断治疗改变了多种实体肿瘤的预后。在肿瘤抗原刺激下,许多肿瘤反应性T细胞作为组织驻留记忆(TRM)样T细胞在周围组织中长期驻留。在瘤床上,表达TCF1的干细胞样CD8+ T细胞,是一种TIM3 - IL7R +CD8+ T细胞,与PD1+ TIM3+ CD8+ T耗竭型细胞共存。T细胞受体(TCR)在干细胞样和终末分化T细胞中具有显著重叠部分,这说明干细胞样肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)可以逐步分化成终末耗竭的TILs。由于TRM样CD8+ T细胞通常缺乏淋巴结归位受体CCR7,TRM样TILs和干细胞样TILs仍是属于不同的群体。在卵巢癌中,免疫检查点阻断治疗未能很好地改善患者的预后,这引起了研究人员对卵巢癌免疫原性的质疑。因此,本研究确定了卵巢癌患者中的TILs可以特异性识别肿瘤抗原,并且起到主要作用的是一小群具有干细胞样TRM样CD8+ T细胞。
二.研究方法
该工作阐述了卵巢癌浸润性CD8+ T细胞的肿瘤识别功能主要取决于于组织驻留记忆(TRM)CD8+ T细胞。该研究对83, 454个CD3+CD8+CD103+CD69+ TRM细胞进行了scRNA-seq、scTCR-seq以及scATAC-seq测序和122个高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)的免疫组化实验结果表明,只有前体组织驻留记忆CD8+ T细胞(TCF1 low TRM stem )可以预测卵巢癌的预后。
三.研究结果
1、TRM样CD8+ TILs表现出胞啃特征,可以识别不同的抗原,并表现出优越的抗肿瘤活性
为了鉴定能够识别肿瘤抗原的TILs,该工作重点研究了CD8+ T细胞,这些细胞表现出胞啃诱导的来自于卵巢癌细胞的EpCAM蛋白转移的迹象。荧光激活细胞分选(FACS)分析和多光谱成像流式细胞术检测发现约有1% ~ 4%的CD3+CD8+ TILs与EpCAM共染色,但在T细胞的mRNA水平上未检测到EpCAM的表达(图1A, 1B)。有趣的是,EpCAM+ TILs也表达CD103和CD69(图1C),呈现TRM样 CD8+ T细胞相关的标记基因,它可以预测卵巢癌中更好的生存。这些细胞共表达CD49a,占HGSOCs样本浸润的CD8+ TILs的60%(图2A)。为了鉴定TRM淋巴细胞的其他特征,比较了来自相同肿瘤的(CD3+ CD8+ CD103+ CD69+ CD49a+)TRM样CD8+ T细胞与(CD3+ CD8+ CD103-)循环CD8+ T细胞(图2A)。TRM样CD8+ T细胞显示T细胞耗竭标志物如PDCD1、LAYN、CTLA4、TIGIT、TOX和HAVCR2的高表达(图2B),暗示了同源抗原的长期暴露。TRM样CD8+ T细胞也表现出较高的效应基因表达,包括IFNG和GZMB,但较低水平的干细胞标志物,如TCF7、IL7R、LEF1、CCR7和CD28。TRM样T细胞也过表达CXCL13,与恶性肿瘤中的B细胞募集和新抗原负荷相关(图2B)。为了进一步支持TRM样CD8+ T细胞与抗原的反复接触结合,差异通路分析鉴定到有丝分裂细胞周期进展特征,以及克隆扩增和肿瘤缺氧相关特征(图2C)。为了证实肿瘤反应性CD8+ T细胞属于组织驻留型CD8+ T细胞,该研究分析了HGSOCs样本的TRM样CD8+ TILs和循环CD8+ TILs的TCR免疫组库。平均而言, TRM样CD8+ TILs和循环CD8+ TILs中共享~12.5%的TCR - β链(图2D)。正如预期的那样,TRM样CD8+ TILs具有较高的克隆多样性(图2E)。为了从功能上验证TRM样CD8+ TILs在体内的保护作用,将OVA特异性的OT-I T细胞转移到同源小鼠发育的侧面OVAlow-UPK10卵巢肿瘤中(图2F)。7天后,40%的肿瘤抗原特异性TILs具有TRM样表型,其余的仍为循环CD8+ TILs(图2G)。TRM样表型的形成依赖于抗原的刺激,因此,未致敏的OT-I T细胞在OVAneg肿瘤中无法获得TRM样的特征(图2H)。最重要的是,从分离的肿瘤中恢复的CD103+ CD69+ 肿瘤抗原特异性TRM样TILs比CD103- OT-I T更有效地抑制了不同的OVAlow肿瘤的生长(图2I,J)。综上所述,这些结果表明,在人类卵巢癌中,TRM样CD8+ TILs和循环CD8+ TILs表现出不同的表型和克隆多样性,并且TRM样CD8+ TILs在瘤床上表现出优越的抗肿瘤活性。
2. TRM样CD8+ TILs呈现从干细胞样T细胞分化为耗竭T细胞的轨迹
对19193个CD103+CD69+CD8+ TRM样CD8+ TILs和24175个循环CD8+ TILs进行了单细胞转录组测序(scRNA-seq),并结合VDJ分析,根据基因表达谱和TCR相似性,确定了CD103+ CD69+ TRM样CD8+ TILs的分化轨迹,CD103-CD69+循环CD8+ TILs转化为TCF7low IL7R+CCR7+CD38- CD8+ T细胞,并保留干性特征(TRMstem)。这些干细胞样CD8+ T细胞分化为GZMB+PRF1+GNLY+ZNF683+ TRM样效应CD8+ T细胞(TRMeff),然后分化为TIGITlowHAVCR2+/lowHLA-DRhighENTPD1+/low TOX+ TRM样具有高增殖特征的CD8+ T细胞(TRMprol),后转化为耗竭的PD-1high HAVCR2highTIGIThighENTPD1highHLA-DR+TOX+CD8+ T细胞(TRMexh)(图3A、3B)。并通过对同一细胞的基因表达和开放染色质的同时分析进一步证实,在这些位点上显示了同步的核RNA表达、富集的开放染色质区域和基因活性(图3B-3E)。这些整合分析揭示了多个共调控基因模块,包括与T细胞干细胞相关的基因(IL7R, CD28, CCR7, CD27, CXCR5),与T细胞效应活性相关的基因(GZMB, GNLY, PRF1, IFNG),与T细胞增殖相关的基因(STMN1, MCM7, TOP2A, CDK1, DNMT1),以及与T细胞耗竭/功能障碍相关的分子(PDCD1, HAVCR2, TIGIT, CTLA4)。还发现了在特定TRM样亚群中差异表达的新标记,例如,在TRMeff/TRMprol/TRMexh分化过程中ETV1的表达逐渐增加。相比之下,GZMK的表达水平在TRMstem细胞中最高,并在耗竭过程中逐渐降低(图3B)。该分析还显示,锌指DNA结合域(ZNF, KLF, SP)在TRMstem细胞中富集,而与核受体和同源结构域(如POU结构域)相关的motif在更分化的TRM样亚群中富集,在TRMexh细胞中FOX和HOX结构域增加(图3F)。进一步的scVDJ分析/RNA-seq分析显示, TRM样CD8+ TILs和24175个循环CD8+ TILs共用13%的TCR(图3G),然而TRMstem与其他TRM样细胞群共享24%的TCR。这些样本中35%的TILs分化为TRMeff和TRMexh细胞,没有TRMstem细胞(图3G)。然而,TRMexh表现出典型耗竭T细胞特征HAVCR2/TOX/ENTPD1/CTLA-4的表达(图3H)。TRMstem细胞中也发现有16%的TCR在TRMexh细胞和其他非干细胞类TRM样细胞群之间共享,类似于感染模型中的干细胞类T细胞,TRMstem细胞的ATAC-seq图谱中没有显示出耗竭的迹象(图3H)。
3. TRMstem预测卵巢癌患者预后
为了进一步确认TRMstem TRMeff TRMprol TRMexh的分化轨迹,进行了额外的scRNA-seq测序,联合VDJ分析了60010个 TRM样 CD8 + T细胞(图4A)。正如预期,与其他TRM样亚群相比,TCF1+ TRMstem细胞表现出较低的CD103表达(图4B、4C)。然而,它们也表达TRM样分化的标志物,包括编码CD49a的ITGA1、RUNX3以及编码LFA-1的两个亚基的ITGAL和ITGB2。TRMstem细胞也表达干细胞样细胞标志物,包括IL7R、CD28和CCR7。与针对特定肿瘤抗原的长期反应一致,TRMexh细胞表现出最高的克隆多样性(图4D和4E)。在这些肿瘤中,57.7%的TRM样克隆型与TRMstem细胞共享998个TCR(图4F、4G)。考虑到只有40%的非冗余TCR存在于TRM样TILs中(而在循环淋巴细胞中这一比例为67%),具有TRMstem免疫组库和分化的TRM样细胞的克隆型仅占TCR的3%(相当于13.4%的CD8+ TILs)。综上所述,这些结果表明,只有一小部分循环CD8+ TILs可转化为TRMstem,随后产生TRMeff/ TRMprol/ TRMexh CD8+ T细胞。为了验证TRMstem TILs在人卵巢癌中的保护作用,接下来对122个不同注释的HGSOCs进行了多重免疫荧光(图5A, B)。TRM样CD8+ TILs与循环CD8+ TILs的高比率与总体生存改善相关(图5C)。值得注意的是,TRM样CD8+ TILs主要位于肿瘤胰岛内,而循环CD8+ TILs分散在基质和肿瘤细胞中(图5D)。表达TRMstem标记物TCF1的CD3+ CD8+ CD103low CD69+ TRM样CD8+ TILs的肿瘤浸润也与改善的预后密切相关(图5E)。相反,TCF1+ CD103- CD8+ 干细胞样循环CD8+ TILs细胞(图5F),或TCF1+ CD103+ CD8+ CD69+ 循环CD8+ TILs细胞(图5G)则不能显著影响预后。类似地,CD103+ CD69+ CD8+ (分化的TRM样)TILs与预后也无显著相关性(图5H)。不同细胞类型间的相互作用分析显示,尽管TRMstem细胞也与CD69+循环CD8+ TILs聚集在一起,但TRMstem细胞与其他TRM样细胞之间存在很强的相关性(图5I,J)。这些实验证实了TRM样细胞的线性分化轨迹,同时也表明TRM样TILs与更好的预后之间的联系取决于TRMstem细胞。
4. T细胞致敏的性能和同源抗原的持久性激活维持了抗肿瘤反应性TRMstem的活性
该研究在体外使用不同剂量的抗原激活OVA特异性T细胞但这并不影响其在OVA+肿瘤中的积累,以及肿瘤反应性TRM样T细胞的比例,或TRMstem/TRMeff的平衡(图6A, B, C)。然而,肿瘤抗原特异性T细胞需要抗原提呈细胞的激活才能在肿瘤中聚集,这表明是T细胞的TME发生代谢性麻痹后无反应(图6D)。为了阐明抗原亲和性在TRMstem分化中的作用,接下来比较了在体外被OT-1 TCR同源抗原(SIINFEKL)激活的OT-I T细胞与低亲和性配体Q4H7 (SIIQFEHL)和G4 (SIIGFEKL)之间的表型差异。低亲和力性配体SIIQFEHL或SIIGFEKL的激活降低了肿瘤反应性OT-I细胞在肿瘤中积聚的能力(图6E)和进行TRM样分化的能力(图6F)。此外,低亲和力Q4H7或G4激活的TRM样TILs中保留TCF1表达的较少,这表明TRMstem形成有缺陷(图6G),相比之下,TRMeff的比例较高(图6H)。除了致敏性能,抗原在肿瘤上的持久性刺激也是TRMstem免疫组库形成所必需的。因此,尽管体外活化的OT-I T细胞在OVA-肿瘤中(图6I),在没有同源抗原刺激的情况下,TRMstem/ TRMeff比值显著降低(图6J)。综上所述,这些研究结果表明,T细胞致敏性能和持久性肿瘤抗原的刺激是TRMstem具备干细胞特性和组织驻留的混合特性免疫组库形成所必需的,并逐步分化成一系列TRM样T细胞,通过主动识别肿瘤抗原,逐步达到耗竭状态。
四、总结
该研究结果为卵巢癌的免疫生物学提供了多方面的见解,为改善免疫治疗提供了新的机会,而免疫治疗对大多数卵巢癌患者无效的原因有很多,例如阻碍T细胞激活,肿瘤的代谢限制,免疫抑制性髓样细胞的积累。首先,该研究证明T细胞的免疫原性,即可以特异性识别肿瘤。因此,可使用特异性TILs扩增或用特定TCR转导的T细胞的个性化治疗卵巢癌。其次,该研究发现TRM样CD8+ TILs及循环CD8+ TILs在表型和抗原识别方面非常不同。第三,确定关键的TRMstem细胞是一种中间细胞类型,同时具有干细胞样和组织驻留特征。有趣的是,在以往的研究中,免疫检查点阻断治疗的有效性被归因于与TRM样CD8+ TILs不同的干细胞样CD8+ TILs亚群的增殖,而也研究发现它依赖于TRM样CD8+ TILs。另一个重要方面是,TRM样分化使肿瘤反应性T细胞能够在瘤床上执行更强的抗肿瘤效应。总之,该研究结果证明一小部分循环CD8+ TILs经历TRM样分化,转化为TRMstem TILs,具有产生新TRM样TILs和执行抗肿瘤效应的能力,而另一些细胞在反复暴露于抗原后会直接进入耗竭状态。