大家好呀，今天分享的文章题为通过整合scRNA-seq和网络药理学来确定骨肉瘤（OS）的治疗靶点，文章思路清晰，于今年一月发表在《Frontiers in Pharmacology》（IF = 5.988）上，让我们来一起学习一下吧！

一、摘要

骨肉瘤（Osteosarcoma , OS）是一种常见的原发性肿瘤，具有广泛的异质性。本研究使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）和网络药理学分析治疗骨肉瘤的有效靶点。本研究共涉及两套数据集：scRNA-seq数据集（GSE162454）、Bulk RNA-seq数据集（GSE36001），采用皮尔逊相关分析确定OS治疗的关键靶点并对关键靶点进行了GO和KEGG分析。DeepDR算法用于预测骨肉瘤治疗的潜在药物。通过分子对接分析，验证了预测药物与关键靶点的结合能力。采用qRT-PCR方法检测成骨细胞和OS细胞中关键靶点的表达。确定了与OS进展相关的5个关键靶点（CD4、RUNX2、OMD、COL9A3和JUN）。长春新碱、地塞米松和长春碱可能与RUNX2、OMD和CD4形成一个很有前途的药物靶点对来治疗骨肉瘤。

二、结果

1、细胞簇的识别和降维分析

首先，作者对单细胞数据进行分析得到21个细胞簇共8种细胞类型，8种细胞类型的差异基因富集得到的KEGG通路存在显著的异质性。

2、不同的细胞类型分析

接下来，作者利用CIBERSORT算法和单细胞数据的8种细胞类型对Bulk RNA-seq （GSE36001）进行注释，之前的研究表明免疫检查点TDO2、PDCD1、LGALS9和PVR在癌症治疗和预后中发挥重要作用，计算免疫检查点表达水平和细胞丰度之间的相关性发现：B细胞和TDO2的表达显著相关、癌症相关成纤维细胞（CAFs）和PDCD1的表达显著相关、内皮细胞和LGALS9的表达显著相关、浆细胞PVR 的表达显著相关。（图2）

3、筛选OS相关的靶点

作者首先从数据库中检索到了4236个OS相关靶点，随后与四种细胞的标记基因进行重叠共得到289个靶点，使用Pearson相关分析筛选表达水平与四种细胞类型丰度显著相关的基因共得到17个关键靶点。通过TARGET数据库搜索这17个靶点和OS生存之间的信息，通过Cox回归分析得到5个与预后相关的靶点（CD4、RUNX2、OMD、COL9A3、JUN）。随后作者基于多变量Cox回归算法构建了由这5个基因组成的联合预后标记物模型。结果显示，这5个关键基因能够准确地评估OS的风险。此外，在OS的3年和5年生存率分析中，受试者操作者特征（ROC）曲线的曲线下面积（AUC）值均大于0.72。众所周知，癌细胞可以通过失调免疫检查点蛋白来进行免疫逃逸。为了验证这5个关键基因对生存风险分组准确性（分为高风险组和低风险两组），作者检测了免疫检查点BTLA和PDL1的表达，低风险组中BTLA和PDL1（CD274）的表达水平高于高风险组。（图3-4）

4、PPI网络的构建与功能富集分析

利用STRING数据库对这17个基因构建蛋白质互作网络（PPIN），得到161个交互关系。（图5）

对这17个基因进行KEGG和GO注释，得到了787个GO term，在生物学过程方面（BP）：与ERK1和ERK2级联、MAPK级联和趋化性的调控有关；在细胞组分方面（CC）：位于转录调控复合物、RNA聚合酶II转录调控复合物和质膜的外侧；在分子功能方面（MF）：与DNA结合转录激活因子活性、RNA聚合酶II特异性、生长因子结合和蛋白酪氨酸激酶活性有关。同时，KEGG分析得到77条通路，主要富集在MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路和人类T细胞白血病病毒一型感染。（图6）

5、药物-靶标相互作用的预测

使用DeepDR算法，获得了10种与OS相关性较高的药物，随后作者利用DeepPurpose算法预测了17个关键靶点与10种药物之间的相互作用关系（图7），筛选得到了6种药物（DB04572、DB01005、DB01234、DB00541、DB00570和DB00309），这些药物可能作用于这17个关键靶点。为了证实这6种药物适合于OS的治疗，本文使用AutoDock Vina对6种药物与CD4、RUNX2、OMD、COL9A3、JUN进行了分子对接分析。对接结果显示：RUNX2、CD4和OMD都与长春新碱（DB00541）、长春碱（DB00570）、地塞米松（DB01234）具有良好的结合亲和力。（图8）

6、细胞验证试验

为评价关键靶点对OS的预后影响，采用RT-qPCR法检测CD4、RUNX2、OMD、COL9A3和JUN在OS和成骨细胞中的表达。结果显示，与hFOB1.19细胞相比，OS细胞中CD4、OMD、JUN的表达降低，而RUNX2和COL9A3的表达增加（图9）。

三、小结

本研究利用单细胞数据对RNA-seq进行注释分析免疫检查点和细胞丰度之间的相关性，发现B细胞与TDO2表达、癌症相关成纤维细胞（CAFs）与PDCD1表达、内皮细胞与LGALS9表达、浆细胞与PVR 表达显著相关。通过数据库筛选出和OS相关的靶点和这四类细胞的标记基因取交集，并进行和细胞丰度相关性分析筛选得到17个靶点，通过数据库寻找这17个靶点和生存之间的关系，筛选出5个和预后相关的靶点构建了风险模型并验证了模型的有效性。通过KEGG和GO分析对这17个靶点进行功能注释，利用分子对接研究靶点潜在药物。本文逻辑清晰，筛选出了OS相关靶点对应的药物并进行分子对接作为验证。感兴趣的小伙伴可以进行复现哦~

Wang Y, Qin D, Gao Y, Zhang Y, Liu Y, Huang L. Identification of therapeutic targets for osteosarcoma by integrating single-cell RNA sequencing and network pharmacology. Front Pharmacol. 2023 Jan 6;13:1098800. doi: 10.3389/fphar.2022.1098800IF: 5.988 Q1 . PMID: 36686663; PMCID: PMC9853455.