肿瘤微环境是一个由多种细胞构成的复杂生态系统,包括癌细胞、免疫细胞和基质细胞,这些细胞之间的相互作用会共同维持肿瘤的发生发展。了解肿瘤微环境中的细胞表型,对了解癌症进展和治疗至关重要,单细胞测序技术的飞速发展也使人们能够在更高分辨率下研究肿瘤微环境。生信人也介绍和分享了很多基于单细胞数据刻画肿瘤微环境的文章,这些单细胞思路有的聚焦免疫细胞、有的关注成纤维细胞等基质细胞、有的会对整个肿瘤微环境进行刻画。小编今天再和大家分享一篇今年六月刚刚发表在 Molecular Cancer(IF:41.444)杂志上的关于前列腺癌微环境中内皮细胞中关键基因的文章。文章结合组织及单细胞数据,生信与实验结合,重点关注内皮细胞这单个细胞类型中的关键基因,并对这个基因的互作与功能进行了详细刻画。文章逻辑非常清晰,有理有据,简洁易懂是一篇十分值得借鉴学习的高分文章。
Comprehensive characterization of the prostate tumor microenvironment identifes CXCR4/CXCL12 crosstalk as a novel antiangiogenic therapeutic target in prostate cancer
全面刻画前列腺癌微环境识别CXCR4和CXCL1交互作为新的抗血管生成治疗靶点
一.研究背景
肿瘤微环境(TME)在肿瘤的进展和治疗调控过程中具有高度动态性和内在复杂性,研究已经发现肿瘤微环境中肿瘤细胞和基质细胞之间的相互作用会促进前列腺癌(PCa)的进展和扩散。因此,深入了解PCa肿瘤微环境(TME)改变过程中的细胞间通信网络能够促进新的治疗策略开发。小编今天介绍的文章就对PCa的肿瘤内皮细胞(TEC)进行了详细的刻画,并解析了TEC和PCa TME之间的细胞交互。
二.文章摘要
文章对从67例根治性前列腺切除术(RP)标本中分离出的TEC进行了多组学体外刻画,并通过免疫组化(IHC)和免疫荧光(IF)对TEC的功能和关键标志物进行了验证。首先,为了识别TEC的细胞与细胞相互作用靶点,作者对4例接受RP的PCa患者进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq),以探索细胞内TME组成。接着作者通过免疫组化、公开数据集、细胞培养实验以及PCa异种移植小鼠模型对靶点进行了验证。结果RNA-seq分析发现与相邻正常内皮细胞(NEC)相比,TEC中肿瘤血管、胶原修饰和细胞外基质重塑相关基因表达上调,这一结果在一个独立患者队列中被IF和IHC证实。此外,通过scRNA-seq,作者识别了27种细胞亚类,包括具有动脉、静脉和未成熟信号的内皮细胞(EC),以及血管生成EC。聚焦分子分析也发现与其他TME细胞亚群相比,动脉TEC显示出CXCL12 mRNA水平升高,并与不良预后相关。
三.数据及方法
1. 生物实验:作者使用根治性前列腺切除术(RP)获得的活检组织样本分离内皮(EC),进行内皮细胞培养。后续也进行免疫荧光(IF)、免疫组化、细胞增殖、划痕迁移实验、细胞面积、细胞核面积、连接长度、定量RT-PCR及小鼠异种移植血管模型的分析。
2. RNA分析和测序:文章进行了组织和scRNA-seq测序。其中RNA-seq分析主要包括:1)数据预处理:作者使用STAR将组织RNA-seq读取序列映射到人类基因组(GRCh38),利用CellRanger软件将scRNA-seq序列映射到人类基因组(GRCh38),并使用UniApp平台分析了原始、未筛选矩阵中的数据。2)质量控制及数据标准化:研究中组织 RNA-seq 数据使用EdgeR包进行标准化,scRNA-seq数据的质控包括: (i) 删除表达小于三个细胞的基因; (ii) 过滤掉基因表达小于200或者大于8000以及线粒体基因表达大于20%的细胞。后续对保留细胞的表达数据进行标准化。
3. 细胞聚类及注释:自动缩放后,作者对标准化数据进行主成分分析(PCA),然后用t-SNE对前20个PCA进行可视化。接着使用Seurat对细胞进行高变基因筛选、标记识别及基于图的聚类,并对细胞簇进行注释。
4. 重新分析公开可用的转录组数据集:研究使用之前发表的meta分析的数据验证CXCL12在小鼠的TEC和NEC中的表达情况。
5. TCGA队列分析:作者下载了TCGA中前列腺腺癌(PRAD)队列的表达及临床数据,在表达及通路水平执行了生存分析及单因素cox分析。此外,作者也执行了GSVA分析评估样本通路富集得分。
四.研究的主要内容及结果
1. 人前列腺组织TEC和NEC的分离、培养及识别
研究首先对从67例前列腺癌RP标本中分离出NEC和TEC进行纯化并筛选EC标记CD31(图1A),并通过免疫细胞学检测典型EC特征确定pca来源的TEC和NEC的内皮表型(图1B)。接下作者通过细胞培养产生足够的细胞数,并对NEC和TEC进行功能特征和组织 RNA-seq等全面分析。结果发现与NEC相比,前列腺TEC表现出细胞增殖和迁移增加(图1C-D)。此外,前列腺TEC在形态学上也有改变,例如整个细胞的大小增加(图1E)以及细胞核面积增加(图1F),不过两种EC的细胞核与细胞的比例大小相似(图1F- G)。此外,作者也在TEC中观察到更多的不连续细胞连接(图1H)。
2. RNA - Seq揭示前列腺TEC和NEC之间的差异
在文章第二部分作者对5例配对TEC和NEC样本以及9例非配对样本进行了组织 RNA-seq,以确定前列腺TEC和NEC之间的分子差异。通过差异基因表达分析,作者识别了TEC和NEC之间驱动的差异基因,并确定了将TEC和NEC分开的40个基因特征(图2A)。接下来作者通过对EC相关基因进行基因集富集分析(GSEA)发现其与肿瘤血管系统相关(图2B)。接着作者使用一个独立的原发性PCa队列对选定的TEC特征进行验证(图2C-E),结果发现与良性前列腺组织中的NEC相比,TEC中所有标记的表达水平均较高,其中包括与血管相关的CXCL12、PTGIR、PLAC9和VDR。此外,体外培养的TEC和NEC中进行的IF实验也证实这一结果(图2F)。这些结果表明培养的前列腺TEC保持了体内TEC的一些特征。
3. CXCL12是前列腺TEC标记物
由于培养的NEC和TEC之间的差异分析表明,CXCL12是上调最明显的基因之一,且这一发现在培养的EC上得到了IF的证实(图3A-B)。因此,在这一部分,作者对TCGA中422例PCa患者队列的公开数据进行深入分析,结果发现CXCL12高表达与显著较高的肿瘤复发率相关(图3C)。接着为了确定CXCL12是否也在其他肿瘤类型的TEC中发生改变,作者使用了公开的TEC和NEC转录组学数据集,并分别对每个数据集进行了一项跨肿瘤的meta分析。结果发现CXCL12在大多数其他肿瘤实体中下调,但在培养的前列腺TEC中高度上调(图3D)。
4. 前列腺TME的单细胞图谱确定了产生CXCL12的细胞类型
在这一部分作者为了研究TEC标志物和CXCL12在全TME中的表达,对4例PCa患者的RP组织进行了scRNA-seq分析(图4A),并对保留的16529个高质量细胞进行了t-SNE可视化和聚类分析,结果识别到B细胞、T细胞、NK细胞、巨噬细胞和单核细胞、肥大细胞、上皮(和癌症)细胞和成纤维细胞(图4B-C)。接着作者通过对单个细胞群进行重聚类和注释,发现总共有27个具有高度不同基因表达特征的亚群(图4D-E)。作者也观察到在不同患者之间,及在肿瘤和良性前列腺组织中,几个亚群的分布存在差异(图4F)。此外,作者识别了两个高表达癌细胞标志物KLK3的上皮簇(图5A)。作者也根据基因特征,将成纤维细胞分为常驻成纤维细胞和基质细胞(图5B),而巨噬细胞和单核细胞则被细分为M1,M2型巨噬细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、树突状细胞和naïve以及激活的单核细胞(图4D-E)。作者对M1和M2亚型巨噬细胞的差异分析也揭示了致癌M2表型的新标记以及CXCL12表达上调(图5C)。
5. 刻画肿瘤细胞内皮细胞亚群
在这一部分,作者对先前分析发现的表达动脉、静脉、未成熟血管等细胞特征的4类肿瘤EC进行了分析(图6A)。作者发现这些细胞群表达高度不同的标志物,其中一些已被IHC验证(图6A-B)。作者通过组织RNA-seq分析发现TEC标志物CXCL12在动脉EC中表达最高(图6C)。通过NEC和TEC的差异分析,作者也发现CXCL12是动脉TEC中上调最高的基因之一(图6D)。此外,作者发现IHC对CXCL12进行的蛋白水平验证与单细胞分析一致,CXCL12在原发性PCa样本的TEC中高度特异表达(图6E)。最后,作者结合TCGA数据发现高表达动脉EC marker的患者预后更差(图6F)。此外,静脉和未成熟细胞的EC亚群特征基因也与不良预后相关(图6G-I)。
6. 相互作用分析揭示CXCR4联合CXCL12是候选的抗血管生成靶点
在文章这一部分,作者进一步评估了CXCL12在动脉EC中的表达,并与所有间质细胞进行了比较。结果作者发现与其他细胞类型相比,CXCL12在与血管生成相关的细胞亚型中显著高表达(图7A),且肿瘤动脉EC表达CXCL12最高,血管生成表型也是如此(图7A)。接着作者为了更好地理解动脉EC相关的CXCL12在PCa TME中的作用,使用CellPhoneDB进行互作分析(图7 B),结果发现在免疫细胞,中存在CXCL12到同源受体CXCR4的信号(图7 B),且与其他EC表型相比,尖端细胞高度过表达CXCR4(图7C)。这些发现表明靶向CXCR4及CXCL12抑制血管生成可能是一个潜在的治疗靶点。
7. 体外和体内CXCR4/CXCL12抑制PCa的功能验证
在文章最后一部分,通过RT-PCR分析,作者发现与NEC相比,TEC中CXCL12及其同源受体CXCR4的表达上调(图8A),且CXCL12与CXCR4互作可以促进血管形成,而CXCR4拮抗剂可以抑制新生血管形成。由于发现CXCR4及CXCL12信号通路会在PCa TEC中触发新生血管,作者验证了CXCR4拮抗剂对TEC增殖能力的降低(图8B),以及细胞迁移的升高(图8C)。接下来作者利用之前的一项小鼠研究,对血管进行了免疫组化,结果发现对照组小鼠的所有肿瘤均有CD31+血管,而在使用CXCR4拮抗剂治疗的6只小鼠的肿瘤中,2只有局灶性瘤内或瘤周血管,与对照组小鼠相比没有出现分布瘤内血管的肿瘤(图8D-E)。
到这里文章的主要内容就介绍完了,文章使用组织及单细胞数据,生信分析及实验验证相结合,深度刻画了PCa微环境中的TEC关键基因的功能来探索其影响肿瘤发展的潜在分子机制,并在复杂的PCa基质细胞相互作用中识别了潜在靶点。文章只重点关注了一个细胞类型,并深度研究了其关键基因的功能,条理清晰,层层递进,有理有据,十分值得小伙伴们参考学习。