内质网应激的癌细胞如何调节抗肿瘤免疫？

在遭受内质网(ER)应激的癌细胞中，未折叠蛋白反应(unfolded protein responses, UPRs)的激活促进了癌细胞的生存。然而，肿瘤细胞中的UPR如何影响抗肿瘤免疫反应的研究仍然很少。今天分享一篇2022年10月发表在Cancer Cell（IF=38.585）的文章。这篇文章分析了肿瘤细胞来源的PERK(pancreatic ER kinase (PKR)-like ER kinase)如何促进免疫逃避，并强调了PERK靶向疗法在癌症免疫治疗中的潜力。

研究背景

大多数肿瘤患者发生的免疫功能改变已成为恶性细胞进展和转移的主要驱动因素，也是开发抗癌疗法的主要限制因素。免疫细胞暴露于肿瘤微环境(TME)中的活性化合物和代谢条件，启动了不同的应激诱导信号通路，这些信号通路可能会限制其抗肿瘤潜力。癌细胞中应激诱导的信号通路与保护性抗肿瘤免疫调节之间的相互作用仍不清楚。

内质网(ER)应激是由多种应激源引起的，包括内质网腔内错误折叠蛋白的积累、营养剥夺、低氧、治疗药物和炎症因子。为了应对内质网应激，癌细胞会激活一个被称为未折叠蛋白反应(UPR)的综合信号网络，其特征是胰腺内质网激酶(PKR)类内质网激酶(PERK)、肌醇所需酶-1a (IRE1a)和激活转录因子6 (ATF6)的激活。

肿瘤细胞死亡过程已成为抗肿瘤免疫的关键调节因子。在局部和远处释放抗免疫应答的癌细胞死亡过程被归为免疫原性细胞死亡(ICD)，其特征是细胞内ATP和HMGB1(high-mobility group box protein 1)的释放、ExoCRT(externalization of calreticulin to the cell membrane)和I型干扰素(IFNs)的产生。尽管ICD是一种有效的治疗肿瘤相关免疫逃避的策略，但诱导ICD以及ICD如何实现保护性抗肿瘤免疫的机制仍不清楚。

这篇文章的目的是阐明癌细胞中PERK激活和肿瘤宿主中免疫逃避之间的交互作用。黑色素瘤细胞中PERK的缺失或抑制限制了它们在ER应激后的生存能力，并导致凋亡介导的ICD，刺激肿瘤内树突状细胞（DCs）产生I型IFN，从而激起单核细胞前体（cMoPs）分化为Ly6C + CD103 +单核细胞系炎症DCs（MoDCs）和T细胞免疫。这些结果支持了针对黑色素瘤的PERK的免疫治疗潜力。

主要结果

癌细胞中的PERK会限制保护性抗肿瘤T细胞免疫

黑色素瘤中PERK信号通路是否影响临床预后和抗肿瘤免疫仍不清楚。为了在缺乏PERK磷酸化信息的情况下评估PERK活性与临床结局的关系，作者根据Connectivity Map平台中A375黑色素瘤细胞系中的EIF2AK3 (PERK编码基因)沉默后减少的前250个转录本开发了PERK活性mRNA signature。研究表明，与肿瘤PERK信号低的患者相比，具有高PERK信号mRNA signature的肿瘤患者的总生存期较短(图1A)。作者还测试了黑色素瘤中的PERK信号是否影响ICI的疗效。对接受抗pd -1和/或抗ctla -4治疗的68例黑色素瘤患者队列进行的回顾性分析表明，与PERK信号转导较低的肿瘤患者相比，PERK信号转导较高的肿瘤患者的ICI应答较为不良(图1B)。因此，人类黑色素瘤中的PERK信号限制了ICI的临床疗效和反应。作者评估了人类黑色素瘤细胞中的PERK激活是否影响肿瘤内T细胞的扩增。在133例转移性黑色素瘤中，对黑色素瘤细胞(SOX10 +)中磷酸化PERK的表达进行了分层，结果与肿瘤内T细胞的频率相关(图1C)。SOX10 +细胞中磷酸化PERK的高表达与肿瘤中CD4 +和CD8 + T细胞的比例降低相关(图1D)，提示黑色素瘤细胞区室中的PERK磷酸化抑制了人肿瘤中的T细胞扩增。为了确定肿瘤细胞内的PERK是否影响抗肿瘤免疫作用，研究人员建立了两个PERK缺失(PERK KO)的黑色素瘤细胞系（SM1 和B16）。在体内，与Scramble或野生型(WT)对照相比，在分别植入PERK KO SM1 和B16肿瘤的C57BL/ 6小鼠中，肿瘤生长明显延迟 (图1E和图1F)。肿瘤细胞选择性缺失一个或两个Eif2ak3等位基因延迟了肿瘤生长 (图1G)。在Rag1-对照组小鼠中或在接受抗cd4或抗cd8抗体治疗的WT小鼠中，由B16或SM1细胞中PERK缺失所触发的抗肿瘤效应被部分阻止 (图1H和1I)，提示T细胞在PERK KO肿瘤中的抗肿瘤作用。与对照肿瘤相比，携带PERK KO B16细胞的小鼠的肿瘤显示出更高比例的CD8 +和CD4 + T细胞、primed CD69 + CD44 + CD8 + T cells、多功能IFN-g + TNF-a + CD8 + T细胞和黑色素瘤抗原gp100特异性EGSRNQDWL- H-2D b -tetramer + CD8 + T细胞，但巨噬细胞、B细胞或NK细胞没有(图1J-1M)。在他莫西芬处理的小鼠的病变中，发现了类似的自发膨胀的gp100反应性CD8+ T细胞的升高（图1N）。与对照组相比，在PERK KO肿瘤的肿瘤内CD8 + T细胞中检测到更高的PD-1水平（图1O）。 另外，与同型处理的PERK KO肿瘤或抗PD1处理的对照组相比，用抗PD-1治疗PERK KO B16小鼠的抗肿瘤效果增强了（图1P）。为了验证治疗模型中PERK的缺失，作者接下来测试了AMG44的抗肿瘤作用，这是一种强效和选择性的PERK抑制剂。抑制PERK影响了小鼠自体黑色素瘤的生长（图1Q）。AMG44治疗还可以延缓B16肿瘤的进展和诱导SM1肿瘤的排斥反应（图1R）。因此，抑制PERK抑制了肿瘤生长并诱导了肿瘤特异性T细胞的扩增。

ER应激肿瘤细胞的PERK消融可引起非凋亡性细胞程序性死亡

为了了解在癌细胞中清除PERK所诱导的免疫刺激效应，作者研究了内质网应激后PERK在肿瘤细胞存活中的作用。与对照组相比，PERK KO肿瘤对内质网应激诱导的细胞死亡表现出更高的易感性，这表明在Thaps治疗后，通过DiOC2(3)检测到Annexin V的结合和线粒体膜电位的去极化更高(图2A)。细胞死亡程序没有在内质网应激的PERK KO肿瘤细胞死亡中发挥必要作用。值得注意的是，与接受相同治疗的Scramble对照组相比，PERK KO黑色素瘤细胞在Thaps治疗后发生了ER肿块增大、错误折叠蛋白积累扩大、维持主动翻译以及活性氧簇(ROS)水平增加(图2B-2D)。此外，在内质网应激源Thaps或衣霉素、饥饿葡萄糖或血清或TES的作用下，PERK KO B16细胞表现出独特的细胞形态，其特征是广泛的细胞质空泡化、完整的细胞核和细胞黏附保留(图2E)。在来自小鼠的PERK KO B16肿瘤中，或在不同应激源(包括Thaps、TES或血清饥饿)的体外治疗后，发现更高水平的SEC61b (图2F)。此外，与相同处理的模拟对照相比，SEC61b沉默阻止了Thaps治疗的Annexin V增加和PERK KO肿瘤中与下垂相关的形态(图2G, 2H)，表明SEC61b在内质网应激后PERK KO肿瘤细胞死亡中的作用。接下来，作者研究了ATF4在PERK敲除肿瘤中发生的细胞凋亡中的作用。在PERK KO肿瘤中，作者发现ATF4 在unresolved内质网应激诱导的SEC61b介导的细胞死亡中发挥潜在作用(图2I)。作者还评估了SEC61b在ICD驱动基因表达中的作用。Thaps处理后，与对照组相比，PERK KO B16细胞显示出更高的ICD hallmarks，包括ATP和HMGB1的释放，以及ExoCRT的诱导(图2J, 2K)。此外，Sec61b siRNA阻断了Thaps处理的PERK KO B16细胞中ATP的释放和ExoCRT的诱导(图2L和2M)，表明在ER应激的PERK KO肿瘤中，Sec61b驱动的非凋亡性细胞程序性死亡在ICD介质的释放中具有上游效应。

黑色素瘤PERK消融可驱动ICD远端抗肿瘤免疫

对来自小鼠的PERK KO B16细胞的分析表明，与对照组相比，ER增大和蛋白聚集增加，以及细胞外ATP、HMGB1和ExoCRT的产生增加(图3A-3E)。此外，与对照组相比，在大量PERK KO肿瘤中检测到I型IFN连锁转录物Ifnb1、Isg15和Ifit3的升高 (图3F)。与ICD评分降低的肿瘤患者相比，ICD mRNA signature升高的肿瘤患者有较长的总生存期 (图3G)，提示ICD对人类黑色素瘤产生影响。为了证实在PERK敲除肿瘤小鼠中ICD的激活，作者测试了远端部位的全身抗肿瘤效应。植入WT或PERK KO SM1肿瘤10天的小鼠被注射另一个位于对侧的WT或PERK KO SM1肿瘤，结果表明肿瘤中PERK的缺失触发了抗肿瘤远隔效应(图3H)。接下来，作者评估了针对PERK KO肿瘤的记忆反应的发展。与未患肿瘤的小鼠相比，之前排斥PERK KO SM1肿瘤的C57BL/6小鼠对WT SM1细胞完全耐药(图3I)。然而，这一保护作用并未发生在无关的 Lewis肺癌肿瘤中(图3J)，表明诱导了保护性肿瘤特异性免疫记忆。

肿瘤中PERK的消融会刺激MoDCs的扩增

荷瘤宿主异常的骨髓造血促进MDSCs的扩增，限制免疫刺激DCs的成熟和功能。与Scramble和WT对照相比，在B16 PERK KO肿瘤中发现MDSCs比例和T细胞抑制活性降低，同时DC频率较高(图4A, 4B)。作者接下来研究了CD11c + DC在PERK KO肿瘤中的抗肿瘤作用。白喉毒素(DT)治疗后，Itgax DTR/EGFP小鼠中的CD11c + -DC缺失恢复了B16 PERK KO肿瘤的生长，而Scramble对照中的生长延迟(图4C)。与来自Scramble对照的DCs相比，来自PERK敲除B16肿瘤的DCs在共培养的初始Pmel CD8 + T细胞中诱导了活化标志物CD44和CD69的高表达，这与PERK敲除B16肿瘤的DCs将肿瘤抗原提呈给T细胞的能力一致(图4D)。这些结果表明，DCs在促进PERK KO肿瘤的抗肿瘤反应中发挥关键作用。与Scramble或WT对照相比，在PERK KO B16肿瘤中检测到的MoDCs比例增加，而不是传统DC(cDC1和cDC2)(图4E)。在他莫昔芬暴露的Braf V600E/+黑色素瘤中也发现了增加的MoDCs扩增 (图4F和图4G)。此外，B16肿瘤细胞中的PERK缺失增加了共刺激分子CD80、CD86和CD40在肿瘤内MoDCs中的表达，而不改变它们在cDC1和cDC2亚群中的表达(图4H)。与cDC1或cDC2相比，MoDCs在TME内显示出较高的eGFP表达，这一情况在Scramble和PERK KO肿瘤中相似(图4I)。这些结果表明，在PERK敲除的肿瘤中，MoDCs扩增，具有更高的吞噬肿瘤产物的能力和免疫刺激潜能。

肿瘤细胞中的PERK控制髓样前体细胞向MoDCs的分化

据报道，MoDCs可由骨髓、脾脏和肿瘤中扩增的cMoPs产生。虽然在骨髓中未发现变化，但与Scramble对照相比，在携带PERK KO B16肿瘤的小鼠中，检测到脾脏和肿瘤中cMoPs的频率较高(图5A)。与perk活性对照相比，在缺乏Eif2ak3或接受AMG44的他莫昔芬治疗的小鼠中，作者发现肿瘤cMoPs有类似升高(图5B)。与对照组相比，在携带PERK KO B16肿瘤的小鼠的肿瘤和脾脏中检测到表达MoDC标志物的cMoPs比例增加(图5C)。与输送到Scramble对照组的相同前体相比，在PERK KO肿瘤中检测到获得MoDC标记的转移cKit +细胞的频率升高。(图5D)。表明在PERK敲除的荷瘤小鼠中，cMoPs进入MoDC中(图5E）。接下来，作者评估了脾源性cMoPs在PERK缺失诱导的抗肿瘤效应中的作用。在B16肿瘤中，在注射肿瘤之前切除小鼠脾克服了抗肿瘤作用，并抑制了PERK缺失诱导的肿瘤相关cMoPs和MoDCs的扩增(图5F-5H)。在携带PERK KO肿瘤的脾切除小鼠中，脾cKit +细胞的转移进一步增加了肿瘤内cMoPs和MoDCs的扩增(图5G和5H)。结果表明，脾脏来源的cMoPs在肿瘤MoDCs中的扩增和在PERK KO肿瘤中观察到的抗肿瘤作用中发挥作用。作者确定了调节cMoPs迁移到PERK敲除肿瘤的介质。与对照组相比，PERK KO肿瘤中CCL2、CCL12、CXCL10、CCL21和CCL11水平升高(图5I)。与对照相比，来自PERK KO肿瘤的cMoPs显示出较高的CCR2表达(图5J)。此外，使用CCR2拮抗剂BMS-CCR2- 22对携带PERK KO b16的小鼠进行治疗后，恢复了肿瘤生长，并损害了cMoPs和MoDCs的瘤内扩增(图5K)。类似地，小鼠中的CCR2缺失挽救了PERK KO肿瘤的生长，并抑制了PERK KO肿瘤中cMoPs和MoDCs的累积(图5L和5M)，这提示CCR2在cMoPs归巢至PERK KO肿瘤中的作用。

I型IFN信号驱动PERK KO肿瘤的抗肿瘤免疫

为了研究Scramble和PERK KO肿瘤中髓系前体细胞的差异，作者通过RNA-seq比较了瘤内cKit +细胞。在携带PERK KO B16小鼠的cKit +前体中，发现了与MoDC功能和I型IFN信号传导相关的明显诱导转录物(图6A, 6B)。与同型处理的对照相比，抗IFNAR1治疗恢复了PERK KO肿瘤的生长，并完全阻止了cMoPs和MoDCs的扩增(图6C和6D)，表明IFNAR1在PERK KO抗肿瘤效应中的主要作用。考虑到死亡的肿瘤细胞可能代表I型IFN的来源，作者接下来测试了在PERK KO肿瘤细胞中I型IFN的产生和信号传导。基于CRISPR-Cas9的Ifnb1缺失(IFN-b1 KO)未能恢复小鼠PERK KO B16肿瘤的生长(图6E)，这表明内在的IFN-b1生成在生长延迟的PERK KO肿瘤中没有发挥作用。为了研究宿主来源的I型IFN信号传导的作用，研究人员将Scramble和PERK KO肿瘤移植到ifnar1缺失的小鼠中。发现注射到ifnar1缺陷小鼠的PERK KO肿瘤生长恢复，cMoPs、MoDCs和gp100反应性CD8 + T细胞的扩增被抑制(图6F-6H)。此外，与对照组相比，在注射到ifnar1缺失小鼠的PERK KO肿瘤中，cmp迁移驱动因子CCR2的表达水平较低，Ccl2 mRNA水平也较低(图6I)。结果证明了宿主来源的IFNAR1信号通路在PERK敲除肿瘤中增强的抗肿瘤免疫反应中的作用。

DC中的I型IFN通过STAT1启动cMoPs向MoDCs的转移

鉴于多个间质亚群可以分泌I型IFN，作者使用IFN-b1-EYFP小鼠来测试I型IFN在PERK KO肿瘤中的产生。虽然巨噬细胞、MDSCs和cMoPs在Scramble和PERK KO肿瘤中具有相似的IFN-b1-EYFP表达，但与对照组相比，PERK KO肿瘤中的DC具有更高的IFN-b1-EYFP表达(图7A)。在DC中，与cDC1或cDC2相比，来自PERK KO B16肿瘤的MoDCs表现出更高的IFN-b1-EYFP表达(图7B)。此外，来自患Scramble和PERK KO肿瘤小鼠的脾脏MoDCs未显著表达IFN-b1水平(图7C)，这表明IFN-b1诱导优先发生于肿瘤内MoDCs。接下来，作者确定了暴露于PERK KO肿瘤释放的ICD介质是否能刺激DC产生IFN-b1。与Thaps外植体培养的DC或溶剂处理的Scramble对照培养的DC相比，暴露于Thaps预处理的PERK KO B16细胞的上清液中来自脾脏或来源于骨髓的DC的IFN-b1-EYFP表达较高(图7D)。为了评估ICD驱动因子在IFN-b1诱导中的具体作用，作者中和了与DNA、HMGB1或ATP相关的信号传导。值得注意的是，在暴露于ER应激的PERK KO肿瘤的上清液的DC中，使用ATP应答性P2X嘌呤受体(P2XRs)、伊文蓝(EvB)或磷酸吡啶-6-偶氮苯基- 20,40 -二磺酸的拮抗剂以及抗HMGB1治疗可损害IFN-b1-EYFP的诱导(图7E)。因此，内质网应激PERK敲除的肿瘤释放ICD相关的ATP和HMGB1，从而触发IFN-b1在MoDCs中的表达。

为了进一步验证在PERK敲除的肿瘤中，cMoPs 向MoDCs的分化是由I型IFN连接的信号调节，研究人员聚焦于STAT1，它被IFNAR1信号激活并影响DC发育。PERK KO b16肿瘤的cMoPs中磷酸化STAT1水平升高，这也依赖于IFNAR1的表达(图7F)。此外，与Scramble对照相比，来自PERK KO B16肿瘤的cKit +细胞的GSEA发现，受STAT1调控的基因的mRNA表达较高。为了测试激活的STAT1是否促进cMoPs 向MoDCs转移，作者用STAT1抑制剂氟达拉滨处理荧光标记的cKit +前体，然后将它们转移到Scramble或PERK KO B16肿瘤中。同样，将荧光标记的cKit +前体从STAT1敲除小鼠转移到肿瘤中，并评估它们向MoDCs的分化。在PERK KO肿瘤中，STAT1抑制或缺失损害了转移的前体细胞向MoDCs的分化(图7G和7H)。这些结果证实了IFNAR1信号通路相关的STAT1在PERK敲除肿瘤中cMoPs 向MoDCs迁移中的作用。

三．总结

本文主要研究了癌细胞对内质网(ER)应激的适应如何调节抗肿瘤免疫。在黑色素瘤细胞中，清除内质网应激相关激酶PERK可通过类凋亡介导的免疫原性细胞死亡激活保护性T细胞应答，通过I型IFN-STAT1启动单核系炎症DCs的扩增。总之，这项研究的结果证明了PERK信号在肿瘤细胞逃避保护性免疫中的关键作用。

参考文献：

Mandula JK, Chang S, Mohamed E, Jimenez R, Sierra-Mondragon RA, Chang DC, Obermayer AN, Moran-Segura CM, Das S, Vazquez-Martinez JA, Prieto K, Chen A, Smalley KSM, Czerniecki B, Forsyth P, Koya RC, Ruffell B, Cubillos-Ruiz JR, Munn DH, Shaw TI, Conejo-Garcia JR, Rodriguez PC. Ablation of the endoplasmic reticulum stress kinase PERK induces paraptosis and type I interferon to promote anti-tumor T cell responses. Cancer Cell. 2022 Oct 10;40(10):1145-1160.e9. doi: 10.1016/j.ccell.2022.08.016. Epub 2022 Sep 22. PMID: 36150390; PMCID: PMC9561067.