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给大家分享一篇刚刚发表在Cell Discovery（IF：38.079）上的文章。作者根据人类和小鼠HCC肿瘤的单细胞RNA测序显示CAF的异质性。这项工作阐明了特定CAF亚群功能在理解肿瘤微环境和免疫系统之间相互作用的重要性。
肝细胞癌(HCC)是一种具有高度细胞异质性的免疫治疗耐药恶性肿瘤。细胞类型的多样性以及肿瘤细胞与非肿瘤细胞之间的相互作用仍有待阐明。80%以上的HCC病例以成纤维细胞的激活、增殖和积累引起的广泛肝纤维化为特征。HCC的肿瘤微环境（TME）的一个显著特征是大量的癌症相关成纤维细胞（CAFs），它可以分泌多种细胞因子、趋化因子和生长因子，直接或间接地支持癌细胞。这些CAF衍生因子对癌细胞来说不仅是直接的生存信号，也通过抑制免疫效应细胞的活性和招募免疫抑制细胞来改变免疫细胞环境，使癌细胞能够逃避免疫监视。在HCC中，基质异质性，特别是CAFs，以及恶性细胞和基质细胞在单细胞分辨率下的相互作用仍然知之甚少。尽管先前的研究报道了CAFs通过各种机制调节肝癌的进展，而不管肿瘤中的CAF亚型如何，目前尚不清楚HCC中是否存在不同的CAF亚群的原机制，而且CAFs与TME中其他成分之间的复杂串扰仍不清楚，特别是对于不同CAF亚型。
来自未治疗的HBV相关HCC（与乙型肝炎病毒有关的肝癌）患者的7个肿瘤和其中4个患者的相邻肝组织的90572个细胞(图1a，b)。使用已知的标记基因可以将细胞划分为9种不同的细胞类型。值得注意的是，上皮细胞和肿瘤细胞以及包括MDSCs、T细胞、DC和CAFs在内的其他细胞具有高度的患者特异性，这表明HCC样本之间存在显著的分子瘤间异质性。
80%以上的HCC病例以成纤维细胞活化和聚集引起的广泛肝纤维化为特征(图1d)。每个亚簇显示出不同的转录组特征(图1e-g)。
接下来，作者进行了更深入的CAF表征，将研究扩展到小鼠HCC模型(图2a，b)。HCC肿瘤中成纤维细胞的比例与人类HCC样本中相似。除胆管细胞外，所有小鼠HCC肿瘤中存在所有类型的细胞。
从7个小鼠肝癌肿瘤的CAFs聚类为7个亚群，每个子簇显示出不同的转录组特征(图2c-e)。人类HCC肿瘤中发现的所有5种CAF亚型在小鼠HCC组织中也有表达(图2c)。CD36+CAFs和lpCAFs富集了上调通路，包括ROS通路和胆固醇代谢(图2f)。
mIF检测发现CD36+ CAFs在人类和小鼠HCC肿瘤的肿瘤核心区域比肿瘤周围区域更富集。此外，BCLC-B中lpmCAFs和lpCAFs的丰度比在BCLC-A期HCC中更丰富。使用荧光激活细胞分选(FACS)分离人类相邻肝组织中的成纤维细胞，发现这些细胞可以聚集成相同的5种CAF亚型。CD36+ CAFs在HCC肿瘤中特异性富集(图3a，b)，而vCAFs在肿瘤中的数量略高于邻近肝组织(图3b，c)，这些结果在独立数据集中得到了验证（图3d，e)。
伪时序分析表明状态转换轨迹包含两个谱系，呈现出从祖细胞状态到终端效应状态的分叉结构(图3f，g)。两个谱系都从“祖细胞”状态开始，在中间状态之后发散。观察到以CAF转分化为特征的mCAFs位于祖细胞状态，lpmCAFs(CD36+ CAFs)处于中间状态，最终分化为vCAFs、lpCAFs和apCAFs，向最终效应状态动态过渡。
之后，作者进行了细胞间相互作用分析。在9种细胞组中检测到71对显著配体受体对，并将其进一步分为25条信号通路(图4a）。MIFCD74/CXCR4在CAFs与B细胞、DC、MDSCs、单核或巨噬细胞、NK细胞和T细胞的相互作用中位居首位。肿瘤细胞和CAFs是MIF配体作用于MDSCs、单核或巨噬细胞和DC的主要来源(图4d)。lpmCAFs和lpCAFs是最主要的MIF配体来源(图4e-h)。MIF的表达主要来源于CD36+ CAFs和lpCAFs，它们是MIF配体作用于MDSCs和DCs的主要来源(图4i)。
作者使用SCENIC识别了CAF亚型中高度活跃的TF及其target(图5a，b)。
这些结果确定了在已确定的CAF亚型中驱动或维持基因表达程序的关键TF，为肝癌肿瘤CAF异质性背后的基因调控网络提供了进一步的见解。
在所有已知的配体-受体对中，MIF信号通路主要由MIF配体及其CD74/CXCR4受体主导，通常高表达CD36的lpmCAFs和lpCAFs是作用于MDSCs的MIF配体的最主要来源(图4g)。免疫组化实验表明，CD36的表达主要位于HCC间质区。因此，使用特异性表面标记物在lpmCAFs 和lpCAFs这两个亚簇中鉴定了CD36，发现它们都富集在脂肪形成途径中(图5g)，表明它们在HCC进展中起着至关重要的作用。MIF实验表明，CD36+ CAFs特异性浸润于肿瘤组织(图5h，i)。
scRNA-seq数据和TCGA数据显示CD36+ CAFs与MDSCs呈正相关，与效应T细胞呈负相关(图5j-l)。此外，对12例HCC肿瘤进行snRNA-seq，发现CD36+ CAFs的数量与MDSCs呈正相关(图5m)。这些结果表明CD36+CAFs可能在HCC中具有有效的免疫抑制作用。
为了分离和表征CAF亚群，作者首先确定了在每个CAF亚群中唯一表达的表面蛋白。在排除免疫细胞和上皮细胞后，锁定了ACTA2阳性细胞(图6a)。使用CD36、CD146、FAP和MHCII抗体，CAFs被分离成4个群体：(1)CD36阳性、(2)MHCII阳性、(3)FAP阳性和(4)CD146阳性细胞，分别对应CD36+ CAFs、apCAFs、mCAFs和vCAFs(图6a)。
CD31和EpCAM双阴性人群中，小鼠和人HCC肿瘤中CAF亚型的比例大致相似(图6b)。CD36阳性CAFs在Cd36、Fabp4和Sh3bp5以及lpCAF标记Fabp5、Apoc1和Fasn的高表达方面是独特的(图6c)。CD36+ CAFs在肝星状细胞(HSCs)中也发现了高表达基因，如Lrat和Gfap31，作者猜测CD36+ CAFs可能起源于HSC。在小鼠肝癌肿瘤中，大约96%的CD36+ACTA2+成纤维细胞是Lrat系阳性细胞。这些结果表明，Lrat系间质细胞是小鼠肝癌发展过程中CD36+ CAFs的主要来源。
qPCR和ELISA实验表明，CD36+ CAFs衍生的MIF表达明显高于vCAFs、mCAFs、apCAFs和HSC(图6d，e)。在CD36+ CAFs中沉默CD36时，MIF的表达和分泌减少，表明MIF的表达可能受到CD36的调控(图6f)。这些结果表明CD36+ CAFs可能通过旁分泌信号促进MDSCs中某些肿瘤促进功能的获得。（CD36是一种清道夫受体，在脂质代谢中起作用，据报道参与炎症反应和代谢障碍，如糖尿病和肥胖。在免疫系统中，CD36已被报道介导树突状细胞抗原的获取和呈递，并支持调节性Tf细胞功能。）
OxLDL是组织中磷胆碱(OxPL)的另一个丰富来源。CD36+ CAFs比CD36kd CAFs具有更高的OxLDL摄取率，CD36+ CAFs脂质过氧化显著增加，并且OxLDL以剂量依赖的方式增强CD36+ CAFs中的脂质过氧化(图6i-l)。
氧化应激可激活p38激酶及其下游信号通路。OxLDL在CD36+ CAFs中诱导p38磷酸化(图6n，m)。这表明OxLDL通过CD36和脂质过氧化促进p38激活。接下来，在p38抑制剂SB203580存在或不存在的情况下，用OxLDL处理CD36+ CAFs。结果显示，OxLDL存在时，p38抑制部分抑制了MIF的分泌(图6o)，表明OxLDL部分通过p38激活促进了MIF的分泌。
对脂质代谢至关重要的CEBP家族(CEBPA和CEBPD)TF在CD36+ CAFs(包括lpmCAFs和lpCAFs)中特异性富集。当CEBPA和CEBPD分别沉默时， OxLDL处理的CD36+ CAFs中MIF显著降低(图6p)。染色质免疫沉淀(ChIP)结果显示CEBPA和CEBPD都可以直接与MIF启动子结合(图6p)。总的来说，这些结果表明CD36通过脂质过氧化/p38/CEBP轴介导OxLDL摄取促进MIF表达。
作者实验发现CD36+ CAF-CM，MIF增加CD33+ MDSCs的数量，CD36+ CAF-CM+ ISO-1和CD36+CAF-CM+ CD74阻断蛋白在抑制CD33+ MDSC扩张方面表现出良好的活性(图7c)，这表明MIF分泌是CD36+ CAFs调节MDSC扩张的重要中介。
共注射从小鼠肝癌肿瘤中分离出的CD36+ CAFs可显著促进小鼠肝脏中肝癌肿瘤细胞的生长或转移，特异性下调CD36、抑制MIF或消耗Gr-1+ MDSCs可大大减弱这种作用(图7d，e)。共注射CD36+ CAFs可显著增加Treg的浸润，减少肿瘤中效应CD8+ T细胞的浸润，特异性下调CD36、抑制MIF或耗损Gr-1+ MDSCs也可显著减弱这种作用(图7f，g)。这些数据表明CD36+ CAFs的促瘤作用是由MDSCs的免疫抑制功能间接介导的。
MDSCs可以通过几种接触非依赖性机制促进免疫抑制，包括诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达，已知iNOS可抑制实体肿瘤中CD8+ T和NK细胞的细胞毒性和功能。首先，作者发现来自CD74或MDSC阻断的细胞的CD36+ CAF-MDSC-CM显著促进了MDSCs中iNOS的分泌(图7h)。此外，共培养实验显示，CD36+ CAF+ MDSC组CD69+、IFNG+ CD8+ T细胞比例明显下调，但Tregs和PD1+CD8+ T细胞比例上调，而CD36+ CAFs+ MDSC+ ISO-1或CD74阻断的影响较小(图7i、j)。这表明CD36+ CAFs通过MIF/CD74/ iNOS轴以成纤维细胞CD36依赖的方式增强CD33+ MDSCs的免疫抑制能力。
肿瘤细胞成球实验结果显示，CD36+ CAF-MDSC-CM极大地促进了HCC细胞系中肿瘤球的形成效率，而CD36+ CAFs或CD33+ MDSCs对CM的刺激只引起轻微的影响。这些结果表明CD36+ CAFs通过旁分泌MIFCD74轴以成纤维细胞CD36依赖的方式增强CD33+ MDSCs的干性增强能力。
最后，为了探索CD36+ CAF衍生的MIF影响MDSCs的分子机制。NF-κB信号通路在CD36+ CAF衍生MIF预处理的MDSCs中被激活(图7k，l)。CD36+ CAFs诱导MDSCs中p65的磷酸化增加(图7m)。据报道，p65激活可显著诱导iNOS和IL-6分泌。CD36+ CAFs或MIF诱导的MDSCs iNOS和IL-6分泌显著上调(图5n)。
为了进一步研究CD36+和MIF+ CAFs是否在HCC的发生中起作用。在小鼠体内敲除CD36或MIF后，HCC肿瘤负荷和MDSCs比例显著降低(图8a-d)，表明CD36+ CAFs参与了HCC的发生。据报道，单核细胞MDSCs具有免疫抑制作用，并与癌症免疫治疗反应差相关。靶向治疗或减少MDSCs联合免疫检查点阻断剂可以增强T细胞免疫治疗。假设CD36+ CAFs的数量与HCC患者免疫治疗的疗效有关。
首先研究了接受抗PD-1治疗的患者。结果显示，抗PD-1应答组CD36和αSMA共表达低于无应答组，表明CD36+ CAFs数量较低预示着更好的HCC免疫治疗应答(图8e，f)。然后，作者又讨论了单药和联合治疗策略。联合治疗在这些HCC小鼠模型中表现出显著的抗肿瘤疗效(图8g-k)，Treg和MDSCs的比例下降，IFN-γ+和颗粒酶B+ CD8+ T细胞的比例增加(图8l-m)。
作者使用scRNA-seq全面描绘了人类HCC的转录组景观，并在单细胞分辨率上揭示了HCC细胞、MDSCs和CD36+ CAFs之间的相互作用。CD36+ CAFs表现出高水平的脂质代谢和巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)表达，CD36+CAFs来源于肝星状细胞。此外，CD36在CD36+ CAFs中通过脂质过氧化/p38/CEBPs轴介导氧化性LDL摄取依赖的MIF表达，CD36+ CAFs以MIF和cd74依赖的方式招募CD33+MDSCs。CD36+ CAFs与HCC细胞共植入促进HCC在体内的进展。最后，CD36抑制剂与抗PD-1免疫治疗协同作用，通过恢复HCC中的抗肿瘤T细胞反应。
