今天给大家分享一篇华西医院乳腺临床研究中心刘小伟团队2023年1月26日发表在Cancer Cell（IF:38.585）上的文章：Immune checkpoint HLA-E:CD94-NKG2A mediates evasion of circulating tumor cells from NK cell surveillance。文章主要介绍了人胰腺导管腺癌循环肿瘤细胞（Circulating tumor cells，CTCs）和自然杀伤细胞（NK）通过免疫检查点分子与HLA-E: CD94-NKG2A相互作用介导肿瘤细胞免疫逃逸。

一．研究背景以及研究方法

目前，在实体肿瘤的原发或转移小生境中，肿瘤细胞与不同类型的免疫细胞之间的免疫检查点分子对已经得到了广泛的研究。然而，对循环中肿瘤细胞的免疫监测研究较少。由于血液循环是肿瘤从原始位点向远处器官转移的主要途径，对血液中肿瘤细胞与免疫细胞相互作用的研究可能提供一种通过激活宿主免疫消除系统来阻断转移的策略。作者团队主要研究（1）在循环中移动的肿瘤细胞是否会受到免疫细胞的攻击;（2）哪种类型的免疫细胞具有免疫消除功能;（3）循环肿瘤细胞（circulating tumor cell, CTC）如何通过抑制免疫检查点对逃脱这种免疫监视。

借助单细胞转录组技术，研究者在单细胞精度上描绘了人胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）的CTC、原发性和转移性病变的转录组图谱。体外和体内的细胞相互作用分析和功能实验研究结果表明，CTC和自然杀伤细胞(NK)通过免疫检查点分子对HLA-E:CD94-NKG2A相互作用介导免疫逃逸。通过阻断NKG2A或抑制HLA-E表达来破坏这种相互作用可以增强NK细胞介导的体外肿瘤细胞杀伤，并在体内防止肿瘤转移。机制研究表明，血小板源性RGS18通过AKT-GSK3β-CREB信号通路促进HLA-E表达，RGS18过表达促进胰腺肿瘤肝转移。总而言之，血小板来源的RGS18通过参与免疫检查点HLA-E:CD94-NKG2A协助CTC逃脱NK介导的免疫监测。免疫检查点HLA-E:CD94-NKG2A信号的阻断可以通过免疫杀伤消除CTC进而来防止体内肿瘤转移。

二．研究结果

1、PDAC 中CTC、原发灶和转移灶的单细胞转录组图谱

通过10X单细胞组学技术获得原发和转移性肿瘤活检以及CTC的单细胞转录组图谱(图1A)。严格质控之后，共获得74,206个单细胞转录组，其中27,296个细胞来自原发肿瘤，36,922个细胞来自肝转移瘤，9,988个细胞来自HPV血液(图1B和1C)。

作者结合单细胞RNA测序 (scRNA-seq) 数据以及经典标记基因并定义细胞群PTPRC^- (CD45^-) 细胞定义为上皮细胞 (EPCAM⁺，KRT8⁺， KRT18⁺，KRT19⁺)，成纤维细胞 (FAP⁺，COL1A1⁺，DCN⁺)，内皮细胞(VWF⁺，CDH5⁺，ENG⁺，PECAM1⁺)。PTPRC⁺ (CD45⁺) 细胞进一步定义为B细胞 (CD79A⁺，CD79B⁺，MS4A1⁺)，髓系细胞 (AIF1⁺，CD14⁺，LYZ⁺，FPR1⁺)， NK细胞 (KLRF1⁺，KLRD1⁺，GNLY⁺) 和T细胞(CD3D⁺，CD3E⁺，CD3G⁺)。CTC由标记基因 (PTPRC^-，PPBP⁺，PF4⁺，CD9⁺，KRT8⁺，TIMP1⁺)，以及采用CopyKT算法进行拷贝数变异(CNV)验证(图1C)。经过严格筛选，共鉴定出523个CTC。

2. CTC、原发灶和转移灶肿瘤细胞的转录特征

差异基因表达分析显示大量血小板相关基因在CTC中显著富集，而在原发灶与转移灶的肿瘤细胞中不富集 (图1D)。有趣的是，CTC中过表达最多的100个基因中，有32个被鉴定为血小板相关基因。作为典型特征，在CTC中观察到EMT相关基因上调和上皮基因丢失 (图1D)。此外，GPCR家族基因RGS18、NRGN、GNG11、CCL5等在CTC中表达显著上调，而核糖体相关基因表达显著下调。

CluGO生物学通路分析结果表明CTC特异性上调了一些通路，包括免疫相关、血小板相关、致癌、细胞周期、凋亡、代谢、EMT、RNA和生物合成等信号通路 (图1E)。更重要的是，与原发和转移性肿瘤相比，CTC中的免疫相关特征更活跃，这意味着CTC与循环中的免疫细胞之间可能存在潜在的相互作用(图1E)。这种相互作用反映了来自宿主免疫系统的监视和CTC的免疫逃逸，很大程度上决定了CTC在转移过程中的命运。

(A) PDAC转移机制研究的实验方案

(B) t-SNE图展示所注释的细胞类型 (n = 18个样本，74,206个细胞)

(C) t-SNE图分别显示原发肿瘤、血液和转移灶肿瘤的细胞类型

(D) CTC与肿瘤细胞之间差异表达的30个上调/下调基因

(E) CTC和原发性/转移性病变肿瘤细胞之间差异富集的信号通路

3. PDAC转移过程中的免疫监测

为了描述CTC的特异性免疫逃逸相关行为，作者对所有CD45⁺ 免疫细胞进行了细分亚群分析 (图2A和2B)。根据典型标记物，免疫细胞可进一步分为8种淋巴细胞亚型，包括NK细胞 (KLRD1⁺，KLRF1⁺)，NK-T细胞(CD3D⁺，CD3E⁺，KLRD1⁺，KLRF1⁺)，CD8耗竭T细胞 (CD8A⁺， PDCD1⁺，LAG3⁺)，CD8效应T细胞 (CD8A⁺，IFNG⁺，GZMA⁺)，记忆T细胞(CD3D⁺，CD44⁺，IL7R⁺，LTB⁺)，naïve T细胞(CD3D⁺，CCR7⁺，TCF7⁺，SELL⁺，LEF1⁺)，Treg细胞(FOXP3⁺，IL2RA⁺) 和B细胞(CD79A⁺， CD79B⁺)。此外还包括七个髓系细胞亚型，即中性粒细胞 (CD14^-，FCGR3B⁺，FPR1⁺)，单核细胞 (CD14⁺，S100A12⁺，FCGR3A⁺)，M1型巨噬细胞 (FCGR3A⁺， CD68⁺，ITGAX⁺，ITGAM⁺)，M2型巨噬细胞 (CD163⁺，MRC1⁺，MSR1⁺)，经典树突状细胞 (cDC; CD1C⁺，FCER1A⁺，CLEC10A⁺)，浆细胞样树突状细胞 (pDC; LILRA4⁺，IL3RA⁺)和肥大细胞(MS4A2⁺，TPSAB1⁺，KIT⁺) (图2C)。

作者用CellPhoneDB研究了肿瘤细胞表面配体-受体对和各亚型免疫细胞的分子相互作用。在原发灶、循环扩散阶段和转移灶中，发现了不同的免疫相关配体-受体对，这意味着肿瘤转移过程中免疫监测的动态变化(图2D-2F)。在原发/转移病灶的微环境中，肿瘤细胞与多种类型的免疫细胞如CD8⁺ T细胞、巨噬细胞、NK细胞等之间存在复杂而密集的相互作用，而肿瘤-免疫在血液循环中的相互作用相对简单，主要观察到CTCs和NK细胞之间具有较强的相互作用(图2E)。

随后，对免疫检查点的配受体对进行表征，结果发现原发病灶和转移灶中相互作用的分子对具有相当大的相似性(图2G)。在原发性和转移性病变中，肿瘤细胞和耗竭T细胞之间发现了强烈的共抑制或共刺激相互作用，例如LAGLS9-HAVCR2、TIGIT-PVR和TIGIT-NECTIN2/3，这意味着PDAC可能是一种潜在的免疫治疗策略(图2G)。

值得注意的是，在循环中的CTC和免疫细胞之间观察到一种独特的免疫检查点分子对模式(图2G)。在这些相互作用的分子对中，HLA-E和CD94-NKG2s被认为是CTC和NK细胞之间最强烈的免疫相互作用，在正向(NK→CTC:CD94-NKG2A:HLA-E, CD94-NKG2C:HLA-E, CD94-NKG2E:HLA-E)和反向(CTC→NK:HLA-E:KLRC1, HLA-E:KLRC2, HLA-E:KLRK1)。进一步解析表明，NKG2A、NKG2C、NKG2D和NKG2E都可能介导这种相互作用。先前的研究表明，CD94-NKG2A异源二聚体作为一种抑制性免疫检查点分子，比其他NKG2亚型发挥主要作用。当NKG2A水平较高时，NKG2C-E的功能可能被抑制。并且观察到，HLA-E在CTC上的表达水平高于实体病变肿瘤细胞(图2H-2J)。因此，NKG2A和HLA-E之间的相互作用上调可能是由HLA-E分子水平的增加引起的。CTCs上HLA-E的上调和NK细胞上CD94-NKG2A的特异性表达模式为它们的相互作用提供了基础(图2K)。

(A) t-SNE图展示所有免疫细胞亚型组成

(B) t-SNE图显示所有免疫细胞的组织来源

(C)热图展示各亚型免疫细胞中标记基因的表达

(D-F) 原发肿瘤(D)、血液 (E)和转移肿瘤(F)中肿瘤细胞/ CTC和免疫细胞之间相互作用

(G)肿瘤细胞/ CTC与免疫细胞之间的免疫检查点相关配体-受体对

(H-J) HLA-E在CTC和肿瘤细胞上的相对表达水平

(K) CD94(KLRD1)和NKG2A(KLRC1)在血液免疫细胞中的相对表达水平

(L)多重免疫荧光验证血液中相互作用的CTC细胞与NK细胞

4. CTC通过免疫检查点HLA-E:CD94-NKG2A逃避NK细胞的监测

NK细胞毒性试验结果表明HLA-E的过表达可以保护PDAC SU86.86细胞免受NK细胞的杀伤(图3A)。使用特异性抗体单抗阻断NKG2A可在HLA-E过表达存在或不存在的情况下增强NK细胞的杀伤能力。类似地，抑制PDAC的HLA-E表达可有效地提高NK细胞杀伤性。Western blot结果显示，典型的免疫检查点信号SHP-1被抑制，而功能酶GZMB在与HLA-E缺陷肿瘤细胞共培养系统分离的NK细胞中上调(图3B)。

为了在体内验证这种免疫检查点功能，作者通过动物模型实验验证(图3C)，结果表明，抗NKG2A阻断抗体能够抑制肿瘤转移，且具有时间依赖性(图3D和3E)。越早阻断NKG2A，越能有效预防转移。在接种肿瘤前阻断NKG2A可显著防止肿瘤转移，而在0天和1天启动的阻断仅部分阻碍肿瘤转移。第3天(第3和第5天)后，NKG2A阻断不再能阻止转移。通过肿瘤淋巴结计数和H&E染色进一步验证结果(图3F-3H)。

与NKG2A抗体阻断的结果一致，生物荧光定量、肿瘤淋巴结计数、H&E染色病结果均显示H2-T23 (HLA-E)下调可明显缓解肺转移(图3I-3M)。为了验证这一免疫检查点分子对的鲁棒性，作者通过让具有免疫功能的小鼠C57/BL6作为受体来重复功能验证(图3N)。通过定量评估接种后15天荧光素酶阳性转移，作者发现NKG2A阻断和H2-T23下调平均分别减轻了63倍和115倍的肺转移的形态学和病理学分析肺解剖结果显示，与空白载体的对照组相比，NKG2A阻断和H2-T23下调明显减轻了转移。这些结果进一步证实了HLA-E:CD94-NKG2A在血液循环转移过程中的免疫检查点功能。在另一个独立队列中，Kaplan-Meier估计结果显示，阻断NKG2A和抑制H2-T23均可显著提高肺转移小鼠在接种肿瘤后27天的总生存率(图3O)。

(A)评估NK细胞对PDAC SU86.86细胞的细胞毒性

(B)检测NK细胞的细胞毒效应酶GZMB和免疫检查点相关激酶SHP1

(C)Balb/c裸鼠静脉接种KPC-Luc细胞，并在指定时间点(-1、0、1、3和5天)开始NKG2A阻断治疗

(D和E)在静脉接种KPC-Luc细胞15天后，通过生物发光成像系统观察(D)和定量(E)肺转移

(F和G)对肺内转移瘤结节进行拍照(F)和定量(G)

(H)用H&E染色评估 (D)的肺病理结果

(I-L)注射H2-T23敲除KPC-Luc细胞的Balb/c裸鼠肺转移的生物发光图像(I)和定量(J)。计数肺肿瘤中肿瘤结节数(K)，显示代表性图像(L)

(M)用H&E染色评估(I)肺的肺病理结果

(N)在静脉接种KPC-Luc细胞15天后，使用生物发光成像系统观察转移到肺的KPC-Luc细胞。C57BL/6小鼠接种前1天用抗NKG2A抗体阻断或静脉移植H2-T23 (HLA-E)敲除的KPC-Luc细胞

(O) Kaplan-Meier图显示KPC-Luc细胞接种小鼠经指示治疗后的总生存率

5. RGS18通过AKT-GSK3β-CREB1轴上调CTC上的HLA-E

为了阐明CTC调节HLA-E表达的具体机制，作者评估了与HLA-E表达水平潜在正相关的差异表达基因 (图2H)。作者团队筛选出一系列HLA-E相关基因，包括PPBP、PF4、NRGN 和RGS18等(图4A)。将这些基因导入两种PDAC细胞系SU86.86和CFPAC-1后，HLA-E表达水平上调。其中RGS18最强(图4B)。为了验证RGS18在CTC中的上调，作者通过免疫荧光染色检测了所有6例接受scRNA-seq的患者活检组织中的RGS18蛋白。RGS18几乎只在CTC中表达，而不是在原发和转移灶的肿瘤细胞中表达(图4C)。

然后，作者探讨了RGS18对HLA-E表达的调节。作为R4亚家族蛋白，RGS18通过Gαi和Gαq负调控GPCR信号通路。通过Western blot实验检测了RGS18过表达的PDAC细胞中潜在的下游通路。通过检测关键激酶的磷酸化，作者发现AKT通路被RGS18过表达特异性地干扰(图4D)。

RGS18上调后，AKT磷酸化下调。随后，GSK3β通过抑制丝氨酸残基9磷酸化而稳定(图4D)。然后GSK3β通过磷酸化丝氨酸残基129来增强CREB1的活性。被激活的CREB1显示出细胞核优先亚细胞定位模式(图4E)。在细胞核中，CREB1与RFX和NFY形成转录正调控复合物，结合HLA-E的启动子结构，该结构由完整的SXY模块和不完整的增强子A和ISRE位点组成。结果显示RGS18过表达上调了三种PDAC细胞系中HLA-E的水平(图4D)。与这些结果一致，CREB1的下调显著下调HLA-E的表达(图4F)。相反，在SU86.86和CFPAC-1细胞中敲除RGS18可增强AKT的磷酸化并破坏GSK3β的稳定。随后，它使CREB1失活并下调HLA-E表达(图4D)。此外，通过两个活化突变体AKT^E17K和AKT^Q79K在PDAC细胞中激活AKT信号，抑制GSK3β，下调CREB1，进而降低HLA-E的表达(图4G)。综上所述，信号通路研究表明RGS18通过AKT- GSK3β-CREB1轴促进HLA-E的表达。

为了验证RGS18的促转移功能，作者通过脾内注射荧光素酶标记的SU86.86 PDAC细胞和人NK细胞，总结了HPV肝转移的过程(图5A)。生物发光图像和信号定量显示，在接种过表达RGS18的SU86.86细胞的小鼠中，肝转移主要发生在肝脏的解剖位置(图5B和5C)。相反，空白载体SU86.86细胞接种对照组小鼠，未见明显肝转移。通过检查解剖的肝脏器官，作者在接种了人RGS18 (hRGS18)过表达PDAC细胞的小鼠中发现了严重的转移性肿瘤，而在对照组中没有发现(图5D)。H&E染色和免疫组化检测EpCAM和RGS18进一步证实了这一结果(图5E)。在另一项独立实验中，RGS18过表达显著降低了肝转移小鼠的总生存率(图5F)。

为了进一步验证RGS18是否通过促进NK细胞的免疫逃逸来促进肿瘤转移，作者进行了肺转移模型实验发现，与肝转移相似，生物发光成像和信号定量结果显示mRGS18通过上调H2-T23显著促进肺转移(图5G, 5H)。在肿瘤接种前1天注射4剂NKG2A阻断抗体可抑制肿瘤转移。肿瘤淋巴结计数和H&E染色进一步证实了这一结果(图5I-5K)。综上所述，这些数据表明RGS18通过上调CTC中抑制性免疫检查点HLA-E在促进肿瘤转移中发挥关键作用。

(A)三维散点图显示CTCs中与HLA-E表达水平相关的差异表达基因

(B)在SU86.86和CFPAC-1中检测HLA-E表达水平，PPBP、PF4、NRGN或RGS18过表达。

(C)通过多重免疫荧光图像显示CTC和患者匹配的原发性/转移性肿瘤中的RGS18

(D)在SU86.86和CFPAC-1细胞中分别检测到RGS18过表达(左)或敲低(右)的AKT-GSK3β-CREB通路活性蛋白和HLA-E。

(E)通过免疫荧光染色可见过表达RGS18的PDAC细胞中p-CREB1的亚细胞分布

(F) western blot检测CREB1敲除的SU86.86和CFPAC-1细胞中HLA-E和CREB1蛋白的表达

(G)在过表达AKTQ79K或AKTE17K突变体的SU86.86中检测AKT- GSK3β-CREB通路活性和HLA-E水平

(A)解剖图显示PDAC肝转移模型的建立，通过半脾注射SU86.86-Luc细胞

(B和C)接种14天后，使用生物发光成像系统对肝转移进行可视化(B)和定量(C)。

(D)按(A)所述治疗的小鼠中解剖的肝转移肿瘤

(E)通过H&E和IHC染色人EpCAM和RGS18评估PDAC肝转移

(F) Kaplan-Meier图显示PDAC肝转移小鼠的总生存期

(G-J)采用小鼠RGS18过表达或不表达的KPC-luc尾静脉注射建立KPC肺转移模型。使用生物发光成像系统对肺转移性KPC肿瘤细胞进行可视化(G)和定量(H)。统计肺内肿瘤结节数(I)，显示代表性图像(J)

(K)用H&E染色评价(G)的肺病理结果

6. CTC通过吸收血小板获得RGS18

众所周知，CTC通常被血小板覆盖，血小板是RGS18蛋白的主要来源。除RGS18外，CTC的scRNA-seq数据中还特异性观察到PPBP、PF4等血小板相关基因 (图1D)。因此，作者推测CTC中的RGS18可能来源于粘附血小板，通过共聚焦显微镜，他们发现血小板不仅在的CTC细胞表面上，而且在CTC细胞中存在(图6A)。当肿瘤细胞与WGA-Alexa594预先标记的患者来源的血小板孵育时，观察到肿瘤细胞内部的荧光信号(图6B)。并且流式细胞术对荧光信号的定量进一步表明，患者来源的血小板被肿瘤细胞以剂量依赖的方式内化(图6C)。然后，研究人员用小鼠PDAC细胞系KPCs孵育人血小板，并通过特定引物的实时qPCR检测供体(人)和宿主(小鼠)RGS18的mRNA水平。结果表明，人类RGS18的mRNA以剂量依赖的方式上调，而不是小鼠RGS18(图6D)。从PDAC患者分离的血小板孵育后，在SU86.86和CFPAC-1中，RGS18和HLA-E水平均以剂量依赖方式上调(图6E)。综上所述，结果表明CTC获得血小板来源的RGS18, RGS18通过AKT- GSK3β-CREB信号通路上调HLA-E的表达(图7)。上调的HLA-E与NK细胞上的CD94-NKG2A相互作用，作为免疫检查点对抑制循环中对CTC的免疫监测。

(A)用免疫荧光标记将CTC与血小板标记物共染色

(B)用WGA594预标记PDAC患者血小板的细胞内定位

(C)孵育24 h后，流式细胞术检测内化WGA594预标记血小板的SU86.86和CFPAC-1细胞

(D) qPCR检测人RGS18和小鼠RGS18相对mRNA表达量

(E) western blot检测PDAC患者血小板处理72 h后SU86.86和CFPAC-1细胞中HLA-E、RGS18和CD41蛋白水平

四、总结

在这里，研究者报道了HLA-E和CD94-NKG2A之间的直接相互作用作为一个免疫检查点，它负向调节NK细胞对CTC的免疫清除。因此，阻断HLA-E:CD94-NKG2A可以通过激活NK细胞消除CTC的功能来防止肿瘤转移。值得注意的是，该方案可能对原发性或已经转移的肿瘤都没有高疗效，因为HLA-E:CD94-NKG2A在实性病变中的表达相对较低(图2G)。这些结果可能部分解释了目前单药抗CD94抗体(NCT02459301, NCT02331875, NCT02557516)临床试验中不满意的结果。此外，在作者纳入的所有胰腺癌病例中都观察到缺乏PD-1:PD-L1相互作用，说明抗PD-1或PD-L1方案在这类恶性肿瘤中的疗效较差。作者的结果还表明，阻断HLA-E:CD94-NKG2A或采用缺乏CD94/NKG2A的CAR-NK细胞可能是预防CTC介导的转移的有前景的策略，特别是在大量的CTC释放到血液中的情况下，例如实体瘤的手术切除。

小编认为这是一个研究癌症转移机制很好的一个范例，从中找到辅助肿瘤细胞转移的“帮手”，进而通过阻断相互作用，达到缓解肿瘤转移的目的，大家如果感兴趣，是不是可以换个癌种试试呢！